兩種抽提乙型肝炎病毒共價(jià)閉合環(huán)狀DNA方法的效果比較

胡孔穎，金宇燾，葉建宇，宰文靜，王洋，李雨檬，陳捷亮

復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)健委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)慢性感染所致慢性乙型肝炎及其相關(guān)肝硬化、肝癌等肝臟疾病嚴(yán)重威脅人類的健康[1]。盡管預(yù)防性乙型肝炎疫苗的使用已大大降低HBV在人群中的感染率，但目前仍缺乏能有效治愈慢性乙型肝炎的藥物和治療手段。HBV基因組以松弛環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)形式包裹在病毒核衣殼內(nèi)，在病毒感染宿主細(xì)胞后，其會(huì)被修復(fù)成環(huán)進(jìn)而以共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)的形式存在于細(xì)胞核中。HBV cccDNA兼具病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制模板和基因儲(chǔ)存庫(kù)的功能，可轉(zhuǎn)錄出各種HBV RNA，進(jìn)而翻譯出包括乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)在內(nèi)的各類病毒蛋白[2]。HBV cccDNA在肝內(nèi)的持續(xù)存在、難以清除是乙型肝炎慢性化和難治愈的關(guān)鍵，也是HBV研究領(lǐng)域的重點(diǎn)[3]。

在HBV cccDNA研究中，HBV cccDNA的準(zhǔn)確檢測(cè)至關(guān)重要，而從細(xì)胞中抽提獲取可供DNA印跡(Southern blot)和定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)檢測(cè)的HBV cccDNA是前提。傳統(tǒng)Hirt法是由Hirt等[4]報(bào)道的用來抽提病毒感染細(xì)胞后存在的非整合病毒DNA的方法。該法利用染色體DNA很長(zhǎng)且與大量蛋白質(zhì)相結(jié)合的特性，以高鹽溶液使染色體DNA沉淀，而游離于染色體外的微小DNA大多不被沉淀而留在上清中，因此被分離[4]。此法結(jié)合酚/氯抽提，很早便應(yīng)用于HBV cccDNA的抽提[5]，但存在操作復(fù)雜和耗時(shí)長(zhǎng)等弊端。為簡(jiǎn)化操作和縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，早前有報(bào)道通過改良Hirt法來快速抽提染色體外DNA，該法裂解細(xì)胞和沉淀染色體DNA的原理類似于傳統(tǒng)Hirt 法，不同之處在于通過改變鹽溶液的溶質(zhì)成分(詳見材料與方法)使蛋白質(zhì)的沉淀更加完全也更迅速[6]，所獲上清不經(jīng)傳統(tǒng)Hirt法中的酚/氯仿抽提步驟，而利用硅膠膜離心柱使染色體外DNA吸附于硅膠膜，隨后通過洗脫完成分離[6-8]，整個(gè)過程僅需2～3 h。與傳統(tǒng)Hirt-酚/氯仿抽提法相比，改良Hirt-過柱法操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)顯著縮短，但尚未被廣泛用于HBV cccDNA抽提，且其抽提效果與傳統(tǒng)Hirt-酚/氯仿法的差異尚不清楚。

基于此，本研究利用多種HBV cccDNA細(xì)胞研究模型，以Southern blot和qPCR為評(píng)價(jià)手段，比較了傳統(tǒng)Hirt-酚/氯仿法與改良Hirt-過柱法這2種方法對(duì)細(xì)胞來源HBV cccDNA的抽提效率。結(jié)果表明，在對(duì)以上來源HBV cccDNA的抽提中，兩種方法具有相當(dāng)?shù)某樘嵝屎统樘崽禺愋裕牧糎irt-過柱法耗時(shí)更短。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系Huh 7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。HepDES19細(xì)胞系由含1.1拷貝HBV基因組的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞建立而成，不表達(dá)HBsAg，且病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制受四環(huán)霉素(doxycycline，Dox)調(diào)控(Tet-off系統(tǒng))[9]，由Jutao Guo教授惠贈(zèng)。HepG2-NTCP細(xì)胞系是整合人NTCP基因、能穩(wěn)定表達(dá)人NTCP 的HepG2細(xì)胞[10]，由Stephan Urban教授惠贈(zèng)。人原代肝細(xì)胞(primary human hepatocyte，PHH)購(gòu)自上海瑞德肝臟有限公司。

1.1.2 質(zhì)粒prcccDNA[11-12]和pCDH-CMV-Cre(構(gòu)建在慢病毒載體上的Cre重組酶表達(dá)質(zhì)粒)由鄧強(qiáng)研究員惠贈(zèng)。

1.1.3 儀器和試劑主要儀器包括酸度(pH)計(jì)(上海天達(dá)儀器有限公司)、二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))、熒光定量PCR儀(Eppendorf，德國(guó))、電泳槽(北京百晶生物技術(shù)有限公司)、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(BIO-RAD，美國(guó))、雜交爐(UVP，美國(guó))。主要試劑包括胎牛血清(fotal bovine serum, FBS)(Biological Industries，以色列)、DMEM(CORNING，美國(guó))、Williams’ Medium E(Gibco，美國(guó))、Trypsin(CORNING，美國(guó))、質(zhì)粒中量抽提試劑盒Nucleo Bond Xtra Midi Plus(Macherey-Nagel，美國(guó))、轉(zhuǎn)染試劑Turbofect(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))、吸附柱(2.0 spin column，QIAGEN，德國(guó))、洗滌緩沖液(Buffer PE，QIAGEN，德國(guó)) 、PCR DIG Probe Synthesis Kit(Roche，瑞士)、DIG Easy Hyb Granules(Roche，德國(guó))、尼龍膜(帶正電荷)(Roche，瑞士)、CDP-Star(Roche，瑞士)、TB Green Premix Ex TaqTM(Takara，日本)、PEG 8000(Sigma，美國(guó))、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(Sigma，美國(guó))、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecylsulfate，SDS)(Sigma，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)Huh 7 細(xì)胞、HepG2 細(xì)胞以及HepG2-NTCP細(xì)胞均在37 ℃ 體積分?jǐn)?shù)5% 的CO2培養(yǎng)箱中用DMEM培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10% FBS，100 U/mL青霉素和100 μg/mg鏈霉素)培養(yǎng)；HepDES19細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)期間在DMEM中添加Dox，使HBV preC/pgRNA不能轉(zhuǎn)錄復(fù)制，到達(dá)所需規(guī)模后，停止添加Dox以使HBV cccDNA積累，每隔3天換液，累積10天后收集細(xì)胞； PHH按照相關(guān)文獻(xiàn)中5種化合物(5 chemicals，5C)培養(yǎng)體系進(jìn)行培養(yǎng)[13]。

1.2.2 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)用轉(zhuǎn)染試劑Turbofect進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，每轉(zhuǎn)染1 μg質(zhì)粒用2 μL的轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染前12 h接種細(xì)胞，使進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)時(shí)細(xì)胞密度處于85%～90%。以轉(zhuǎn)染1 μg質(zhì)粒DNA為例，在1.5 mL EP管中加入100 μL DMEM，加入1 μg質(zhì)粒DNA后充分混勻，加入2 μL轉(zhuǎn)染試劑Turbofect后再混勻，室溫靜置15 min后將其緩慢加入被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞孔板內(nèi)，做好標(biāo)記。12 h之后對(duì)被轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行換液。

1.2.3 HBV感染實(shí)驗(yàn)感染前24 h將HepG2-NTCP細(xì)胞、PHH分別接種到24孔板中，每孔約2.5×105個(gè)細(xì)胞。感染時(shí)所用的HBV病毒濃縮液來自本實(shí)驗(yàn)室濃縮的HepAD38細(xì)胞(受Dox調(diào)控的HBV復(fù)制細(xì)胞系[14])上清液，其滴度為2×109IU/mL，按照感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為200進(jìn)行感染。感染PHH時(shí)，參照PHH-5C的感染模型[13]，每孔的感染體系為：Null medium 425 μL，0.4 g/mL PEG8000 50 μL，HBV濃縮液 25 μL；感染24 h之后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)洗滌3遍換新鮮的5C培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每隔3天換液，9天后收樣備測(cè)HBV cccDNA。感染HepG2-NTCP細(xì)胞時(shí)每孔的感染體系為：DMEM培養(yǎng)基412.5 μL，0.4 g/mL PEG8000 50 μL，DMSO 12.5 μL，HBV 濃縮液 25 μL；感染12 h后用PBS洗滌5遍，換新鮮的DMEM(含體積分?jǐn)?shù)為10% 的FBS)進(jìn)行培養(yǎng)，每隔3天換液，9天后收樣備測(cè)HBV cccDNA。

1.2.4 傳統(tǒng)Hirt-酚/氯仿法抽提DNA以6孔板為例，從培養(yǎng)箱中取出的細(xì)胞以預(yù)冷PBS洗滌2遍之后，每孔加750 μL的TE buffer [10 mmol/L Tris-HCl, pH值7.5; 10 mmol/L 乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)]和 50 μL 的10 % SDS，輕柔混勻后室溫裂解30 min。將粘性裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加200 μL 5 mol/L NaCl，上下輕柔顛倒混勻10次，4 ℃放置至少16 h后離心(4 ℃，14 500 g，30 min)。上清液轉(zhuǎn)移至新2 mL離心管中，加等體積飽和酚，手動(dòng)搖勻呈乳濁液，離心(4 ℃，3 500 g，10 min)，接下來重復(fù)該步驟1次；上層水相轉(zhuǎn)移至新2 mL離心管中，加等體積酚/氯仿，手動(dòng)搖勻，離心(4 ℃，3 500 g，10 min)；上層水相轉(zhuǎn)移至新2 mL離心管中，加等體積異丙醇，上下顛倒混勻，-20 ℃靜置過夜。離心(4 ℃，10 000 g，30 min)后棄上清液，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇洗一次，棄去乙醇，待乙醇揮發(fā)完后，ddH2O溶解沉淀。

1.2.5 改良Hirt-過柱法抽提DNA以6孔板為例，從培養(yǎng)箱中取出的細(xì)胞以預(yù)冷的PBS洗2遍之后，每孔加500 μL的Buffer 1(50 mmol/L Tris-HCl， pH值7.5, 10 mmol/L EDTA, 50 μg/mL RNase A)和500 μL的Buffer 2(0.012 g/mL SDS)，輕搖混勻后室溫孵育15 min。接著加 700 μL 的Buffer 3 (3 mol/L 氯化銫, 1 mol/L 醋酸鉀, 0.67 mol/L 醋酸)，4 ℃孵育2 h。4 ℃下以 15 000 g離心15 min。收集上清液，將其轉(zhuǎn)移到吸附柱中，室溫下以 15 000 g離心1 min。在吸附柱中加入750 μL Washing buffer，室溫下以 15 000 g離心1 min。棄去收集管中的廢液，室溫下以 15 000 g離心1 min。在吸附柱中加入60 μL ddH2O，室溫下以 15 000 g離心1 min。

1.2.6 Southern blot 檢測(cè)cccDNA 抽提效果具體方法參照文獻(xiàn)和本課題組先前報(bào)道[15-16]，簡(jiǎn)述如下：配制濃度為0.01 g/mL的瓊脂糖凝膠，上樣，70 V 電泳約2 h。取出凝膠，依次用酸變性液變性 10 min、堿變性液變性1 h、中和液中和1 h。結(jié)束后，將凝膠、裁剪好的尼龍膜、濾紙浸泡入含有 3 mol/L 氯化鈉、0.3 mol/L二水合檸檬酸三鈉的轉(zhuǎn)移液(20×SSC)中。轉(zhuǎn)膜過夜后，將尼龍膜在2×SSC溶液中浸泡5 min，接著紫外交聯(lián)2 min。將尼龍膜放入雜交管中，加入5 mL的預(yù)雜交液，42 ℃預(yù)雜交30 min。取出預(yù)先用地高辛標(biāo)記好的探針，100 ℃變性5 min，迅速冰浴3 min。將探針加入新的預(yù)雜交液中，配制形成雜交液。倒出預(yù)雜交液，換成雜交液，42 ℃雜交6～8 h。高鹽溶液洗膜2次，每次5 min。低鹽溶液洗膜2次，每次15 min。后續(xù)洗滌、封閉和抗體孵育等步驟中雜交爐溫度均設(shè)定為 37 ℃。洗滌緩沖液潤(rùn)洗1～5 min。封閉緩沖液封閉30 min。Anti-DIG 抗體稀釋液孵育 30 min。洗滌緩沖液洗2次，每次15 min。顯色緩沖液潤(rùn)洗 2～5 min。在尼龍膜上覆蓋CDP-Star工作液，室溫避光5 min，顯影30 min以上。

1.2.7 qPCR檢測(cè)cccDNA 抽提效果利用SYBR Green法檢測(cè)兩種方法抽提到的rcccDNA和線粒體DNA(內(nèi)參基因)，使用的引物序列見表1。反應(yīng)體系如下：反應(yīng)混合液(2×)10 μL，正向引物、反向引物 (終濃度均為10 μmol/L)各0.3 μL，DNA樣本 2 μL，去離子水補(bǔ)足至20 μL。按如下程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)：95 ℃ 2 min預(yù)變性后，95 ℃ 15 s、59 ℃ 15 s、72 ℃ 20 s重復(fù)45個(gè)循環(huán)。

表1 PCR引物序列

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析各實(shí)驗(yàn)組均經(jīng)獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，每組實(shí)驗(yàn)測(cè)定3個(gè)樣本數(shù)據(jù)，作圖采用GraphPad(Prism 6)，顯示測(cè)定結(jié)果的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，并進(jìn)行t檢驗(yàn)，P≤0.05代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 HBV cccDNA轉(zhuǎn)染系統(tǒng)中，傳統(tǒng)Hirt-酚/氯仿法與改良Hirt-過柱法抽提效率相當(dāng)

選擇Huh 7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，分別在這兩種細(xì)胞中轉(zhuǎn)染prcccDNA和pCDH-CMV-Cre，轉(zhuǎn)染3天后，分別用2種抽提方法抽取DNA，之后用Southern blot和qPCR(特異性引物P3、P4)對(duì)HBV rcccDNA進(jìn)行檢測(cè)(見圖1A、1B)。

Southern blot結(jié)果顯示，從轉(zhuǎn)染prcccDNA和pCDH-CMV-Cre的Huh 7細(xì)胞、HepG2細(xì)胞中，分別用兩種方法抽提得到的樣本均可在約2.0 kb處檢測(cè)到明顯條帶(見圖1C)。由于rcccDNA含一個(gè)EcoR I位點(diǎn)，樣品經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR I處理后，Southern blot顯示條帶均上移。同時(shí)，在prcccDNA和pCDH-CMV-Cre轉(zhuǎn)染量不同的情況下，傳統(tǒng)Hirt-酚/氯仿法與改良Hirt-過柱法抽提到的HBV rcccDNA條帶大小特征無明顯差異(見圖1C)。qPCR結(jié)果亦顯示，兩種方法均可抽提到HBV的rcccDNA(見圖1D)，隨著prcccDNA和pCDH-CMV-Cre轉(zhuǎn)染量的增加，以引物P3、P4檢測(cè)到的HBV rcccDNA含量也增加，且在同等rcccDNA轉(zhuǎn)染量之下，改良Hirt-過柱法與傳統(tǒng)Hirt-酚/氯仿法抽提所得rcccDNA樣品的檢測(cè)讀值接近，提示兩種方法的抽提效率相當(dāng)(見圖1D)。

2.2 HBV復(fù)制細(xì)胞系(HepDES19)系統(tǒng)中，改良Hirt-過柱法抽提效率略高

培養(yǎng)HepDES19細(xì)胞，待HBV cccDNA積累10天后，對(duì)相同細(xì)胞量的細(xì)胞分別用兩種抽提方法抽提DNA后，分別用qPCR(引物PcccDNA1、PcccDNA2)和Southern blot對(duì)以上2種方式得到的DNA進(jìn)行檢測(cè)，比較其對(duì)HBV cccDNA的抽提效率(見圖2A)。Southern blot結(jié)果表明，傳統(tǒng)Hirt-酚/氯仿法與改良Hirt-過柱法抽提得到的HBV rcDNA和雙鏈線性DNA(dslDNA)條帶的帶型和灰度類似，但在改良Hirt-過柱法中cccDNA條帶信號(hào)較強(qiáng)(見圖2B)；進(jìn)一步使用ATP依賴的DNA酶(Plasmid-SafeTMATP-dependent DNase，PSD)對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)酶切后，利用qPCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明改良Hirt-過柱法抽提得到的HBV cccDNA含量略高，但與傳統(tǒng)Hirt-酚/氯仿法相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見圖2C)。

2.3 HBV體外感染系統(tǒng)中，傳統(tǒng)Hirt-酚/氯仿法與改良Hirt-過柱法抽提效率相當(dāng)

在HepG2-NTCP感染系統(tǒng)中，HBV感染HepG2-NTCP細(xì)胞9天(見圖3C)后，將相同數(shù)量的細(xì)胞分別用3種方法(抽取細(xì)胞核內(nèi)總DNA、傳統(tǒng)Hirt-酚/氯仿法、改良Hirt-過柱法)抽提DNA，抽提到的細(xì)胞核內(nèi)總DNA取部分利用PSD消化去除非閉合環(huán)狀的HBV rcDNA，之后用qPCR(引物PcccDNA1、PcccDNA2)對(duì)以上3種方法得到的DNA進(jìn)行檢測(cè)，比較其對(duì)HBV cccDNA的抽提效率(見圖3A)。結(jié)果表明，細(xì)胞核內(nèi)總DNA抽提所得樣品中HBV cccDNA拷貝數(shù)最高，經(jīng)過PSD消化后拷貝數(shù)有所降低(去除了rcDNA非特異性干擾)，該拷貝數(shù)與傳統(tǒng)Hirt-酚/氯仿法與改良Hirt-過柱法抽提所得樣品中的HBV cccDNA拷貝數(shù)相當(dāng)，且后兩種抽提方法檢測(cè)值間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見圖3B)。

A: Schematic model of two methods of HBV cccDNA extraction. B: The experimental flow of the preparation and detection of HBV rcccDNA samples in Huh 7 and HepG2 cells-based system. C: Southern blot detection of the rcccDNA extracted by the two indicated methods. D: Quantification of the extracted rcccDNA using qPCR.

A: The experimental flow of the preparation and detection of HBV rcccDNA samples in HepDes19 cells. B: Southern blot detection of the rcccDNA extracted by the two indicated methods. C: Quantification of the extracted rcccDNA using qPCR.

在PHH-5C感染系統(tǒng)中，HBV感染PHH 9天后，分別用傳統(tǒng)Hirt-酚/氯仿法與改良Hirt-過柱法抽提DNA，之后用qPCR(引物PcccDNA1、PcccDNA2)檢測(cè)抽提所得樣品中HBV cccDNA的含量(見圖3A)。結(jié)果表明，在PHH-5C感染系統(tǒng)中，2種抽提方法所測(cè)HBV cccDNA含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見圖3C)，提示抽提效率相當(dāng)。

A: The experimental flow of the preparation and detection of HBV rcccDNA samples in HepG2-NTCP-and PHH-based infection assay. The cells were harvested at day 9 post HBV infection. B and C: Quantification of the extracted rcccDNA using qPCR.

2.4 改良法抽提cccDNA所用硅膠膜離心柱選擇范圍較廣

鑒于市售商業(yè)化硅膠膜離心柱材質(zhì)和性能的不盡相同，為比較不同制造商來源硅膠膜離心柱用于rcccDNA抽提的效率差異，本研究選用7家不同公司來源的硅膠膜離心柱，分別是QIAGEN(27106)、Axygen(AP-NW-P-250)、MACHEREY-NAGEL(740588.250)、SparkJade(AD0105)、Thermo Fisher(K0503)、TransGen Biotech(ER5001)、TIANGEN(DP105-03)，括號(hào)內(nèi)為貨號(hào)?；贖uh 7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染prcccDNA和pCDH-CMV-Cre的研究模型，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞均分為8份，分別用傳統(tǒng)Hirt-酚/氯仿法和使用上述7種硅膠膜離心柱的改良Hirt-過柱法抽提DNA。

Southern blot結(jié)果顯示，不同制造商來源硅膠膜離心柱均可抽提獲得目標(biāo)rcccDNA，且抽提所得含量基本相當(dāng)，其中QIAGEN、Axygen、Therm Fisher及TIANGEN等的硅膠膜離心柱對(duì)rcccDNA的抽提效率相對(duì)略高。上述結(jié)果提示，在改良Hirt-硅膠膜離心柱法抽提cccDNA時(shí)，硅膠膜離心柱有著較廣的選擇范圍(見圖4)。

Note: Southern blot detection of the rcccDNA extracted by the indicated methods.

3 討論

HBV cccDNA是乙型肝炎慢性化和難以治愈的“元兇”，實(shí)現(xiàn)對(duì)其的清除或長(zhǎng)期功能性抑制是功能性治愈乃至根除乙型肝炎的關(guān)鍵。然而，目前對(duì)于HBV cccDNA的形成、調(diào)控以及代謝清除等相關(guān)機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍不十分深入，相關(guān)靶向cccDNA的手段仍在研發(fā)推進(jìn)中。在HBV cccDNA研究中，準(zhǔn)確進(jìn)行HBV cccDNA檢測(cè)至關(guān)重要；同時(shí)在臨床，結(jié)合血清HBV病毒載量水平、抗原水平和ALT水平等常用診斷指標(biāo)，HBV cccDNA檢測(cè)對(duì)于乙型肝炎的病原學(xué)診斷、疾病進(jìn)程分析和療效預(yù)后的判斷等具有重要意義。

Southern blot和qPCR是目前檢測(cè)HBV cccDNA的兩大方法，而前提是從細(xì)胞中抽提獲取可供檢測(cè)的cccDNA樣品。傳統(tǒng)Hirt法在TE buffer(pH值為7)環(huán)境下用SDS裂解細(xì)胞，再加入高鹽溶液使蛋白質(zhì)在鹽析作用下發(fā)生沉淀。染色體DNA分子量大且與大量蛋白質(zhì)相結(jié)合，所以會(huì)與蛋白質(zhì)一同被沉淀下來。染色體外DNA因分子量小且大多仍存在于上清液中，故可對(duì)上清液進(jìn)行酚/氯仿抽提，再以乙醇(或異丙醇)沉淀過夜，可獲得“Hirt DNA”，整個(gè)過程需要2～3 d[4, 17-19]，耗時(shí)較長(zhǎng)。為縮短操作時(shí)間，有報(bào)道通過改變鹽溶液的溶質(zhì)成分使蛋白質(zhì)的沉淀更加完全也更迅速，即改良Hirt法。此法去除沉淀物后得到的溶液可經(jīng)硅膠膜離心柱分離抽提，相較酚/氯仿抽提進(jìn)一步縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，但尚未被應(yīng)用于HBV cccDNA抽提[6]。

本研究基于常用HBV cccDNA細(xì)胞研究模型(瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、HBV復(fù)制細(xì)胞系及感染系統(tǒng))，比較了改良Hirt-過柱法與傳統(tǒng)Hirt-酚/氯仿法對(duì)cccDNA的抽提效率和所需實(shí)驗(yàn)時(shí)間。結(jié)果表明，兩種抽提HBV cccDNA方法的得率相當(dāng)，但改良Hirt-過柱法(2～3 h)與傳統(tǒng)Hirt-酚/氯仿法(2～3 d)相比可顯著節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高效率。需注意的是，Southern blot結(jié)果顯示(見圖2B)，傳統(tǒng)Hirt-酚/氯仿法和改良Hirt-過柱法抽提得到的Hirt DNA均包括rcDNA，都無法達(dá)到對(duì)cccDNA的特異性抽提。此種情況下，Southern blot檢測(cè)可通過區(qū)分條帶大小和通過EcoR I酶切實(shí)驗(yàn)來分辨cccDNA；而在進(jìn)行qPCR時(shí)，雖然采用了cccDNA特異性引物，但有研究表明仍無法避免擴(kuò)增出rcDNA[20]，因此建議使用PSD、T5和Exonuclease Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ等進(jìn)行預(yù)酶切[21-22]，以盡量消減rcDNA對(duì)定量結(jié)果的影響。

鑒于HBV cccDNA是一種類似質(zhì)粒的微小環(huán)狀DNA，有報(bào)道采用質(zhì)粒抽提中的“堿裂解法”對(duì)HBV cccDNA進(jìn)行抽提[6, 23-24]。此方法中，rcDNA自身具有缺口，非完整閉合環(huán)狀DNA，在堿變性后無法復(fù)性，而cccDNA易于復(fù)性，故該法在抽提cccDNA的過程中具有更高的特異性。但是，由于部分cccDNA在堿裂解法中也無法復(fù)性，該法更易造成樣品中cccDNA的損失。cccDNA在自然感染情況下細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)很低，因此該法無法很好地適用于微量樣品。須指出的是，本文所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果都以細(xì)胞實(shí)驗(yàn)為主，未采用臨床乙型肝炎患者的肝臟穿刺樣本對(duì)兩種方法進(jìn)行比較。雖然，本文所得出的“兩種方法抽提效能類似”的結(jié)論在理論上亦適用于臨床標(biāo)本，但須進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)評(píng)估驗(yàn)證。總之，本研究提示在進(jìn)行細(xì)胞HBV cccDNA抽提時(shí)可選擇改良Hirt-過柱法以提高實(shí)驗(yàn)效率，其亦適用于大規(guī)模cccDNA的抽提實(shí)驗(yàn)。