結合WGCNA構建與豬肌肉脂肪酸相關的調控網絡

劉 娟，王 舒，左 周，路 暢，蔡春波，楊 陽，趙 燕，高鵬飛

（山西農業大學動物科學學院，山西太谷030801）

豬肌肉中脂肪層次多，結締組織少，是人們獲取營養物質的重要來源之一，深受人們喜愛[1-2]。隨著我國社會經濟的快速進步和發展，人們對于肉品質的追求也逐步提高，營養綠色保健型肉品成為了人們新的追求[3]。肌肉中的脂肪對肉的嫩度、多汁性和風味有重要影響，而脂肪酸是脂肪沉積的物質基礎[4]。脂肪酸的組成不同，會對肉的風味和營養特性產生影響。單不飽和脂肪酸比多不飽和脂肪酸具有更強的氧化穩定性，能改善肉的口感和色澤[5]，而多不飽和脂肪酸降低了人們患心血管疾病的風險[6]。因此，構建與脂肪酸組成相關的調控網絡，篩選網絡中的關鍵調控分子是非常必要的。

迄今為止，國內外學者已經獲得了很多影響脂肪酸組成的關鍵mRNA以及lncRNA。已有研究表明，長鏈脂酰輔酶A合成酶1（ACSL1）可參與吸取外來脂肪酸的調節作用，促進油酸的攝入而增加甘油三酯中油酸的沉積，提高細胞內不飽和脂肪酸的沉積[7]。CRIADO-MESAS等[8]通過GWAS分析發現，不同豬品種胰島素樣生長因子2（IGF2）存在多態性，攜帶A等位基因的動物IGF2表達增加，則多不飽和脂肪酸含量升高、單不飽和脂肪酸含量降低。SHANG等[9]以藏豬和大白豬為研究對象，分析2個品種脂肪酸組成顯著差異的分子機制，結果表明，長非編碼RNAMSTRG.14097和MSTRG.8034等在脂肪和脂肪酸組成性狀中發揮重要作用。據報道，lncRNA-PU.1可以和mRNA形成雙鏈復合物，抑制PU.1基因的翻譯過程，進而可以調節脂肪的形成[10]。lncRNA-Blnc1在小鼠中形成核糖核蛋白，與EBF2組成復合體，增強棕色和米色脂肪細胞分化[11]。

加權相關網絡分析（WGCNA）是用于加權基因共表達網絡分析的R包，可以用作數據探索工具或基因篩選（排序）方法來查找高度相關的基因的簇（模塊）[12]。YANG等[13]利用WGCNA篩選膠質母細胞瘤的候選生物標志物，并進行分子機制研究。MAERTENS等[14]通過WGCNA分析，顯示了與雙酚A劑量反應相關的新型轉錄因子。DING等[15]將WGCNA和血清代謝組學相結合揭示了與肺癌相關的無序葡萄糖代謝過程。

馬身豬和大白豬是品種特性相差非常大的2個豬品種。本研究對馬身豬和大白豬不同生長階段背最長肌組織進行轉錄組測序，采用WGCNA方法進行網絡構建和模塊查找，找到涉及豬肌肉脂肪酸組成的生物過程和途徑的重要模塊，以期獲得影響豬肌肉脂肪酸組成的關鍵調控分子。

1 材料和方法

1.1 樣品采集與處理

飼養試驗于山西省大同市種豬場進行，選用馬身豬和大白豬為研究對象，分別在1日齡、90日齡和180日齡隨機選擇3頭體質量相近的去勢公豬屠宰取樣，采集心、肝、脾和背最長肌等8種組織樣品，液氮保存備用。

1.2 轉錄組測序

對2個品種的18個樣品進行轉錄組測序，獲得不同生長時期肌肉組織mRNA和lncRNA表達譜，數據NCBI登錄號為SRP068558。使用R包limma進行差異基因分析，DEG的閾值設置為|log2（foldchange）|＞0.8且P＜0.05。進一步篩選18個樣本中FPKM值均高于1的mRNA和lncRNA。

1.3 WGCNA分析

使用R語言包WGCNA構建差異mRNA和lncRNA無尺度網絡。首先，對所有成對mRNA或lncRNA進行相關性分析，然后利用冪函數amn＝|cmn|β（cmn表示m和n之間的皮爾森相關性；amn表示m和n之間的鄰接性；m、n可以是mRNA也可以是lncRNA）構建鄰接矩陣。確定軟閾值參數β，將鄰接矩陣轉化為拓撲重疊矩陣，并計算相應的不相似性（1-TOM）。設置模塊最少基因數為30，基于TOM的度量方法進行層次聚類，將表達譜相似的mRNA、lncRNA劃分為同一模塊。

將模塊特征基因（MEs）作為各基因模塊的特征向量，代表各模塊基因的表達模式。此外，計算MEs與11種脂肪酸（棕櫚酸（Pal）、硬脂酸（Ste）、油酸（Ole）、亞油酸（Lin-2）、亞麻酸（Lin-3）、花生酸（Ara）、花生酸-烯酸（Ara-4）、飽和脂肪酸（SFA）、不飽和脂肪酸（UFA）、單不飽和脂肪酸（MUFA）和多不飽和脂肪酸（PUFA））之間的相關性。

1.4 功能富集分析

為探索模塊中潛在的生物學功能和基因途徑，使用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）對基因參與的生物學過程以及信號通路進行注釋。結合模塊特征基因與性狀相關性以及富集分析結果，確定感興趣模塊。利用Cytoscape插件ClueGO將篩選到的模塊基因的生物學過程、信號通路以及一些mRNA組成的網絡圖可視化。

1.5 模塊樞紐基因的選定

在分析一個網絡的關鍵節點時，就要提到度（Degree）這個概念，假如有50個基因，有30個基因和A基因相連，那么A基因的度就是30。cyto Hubba是一款基于軟件Cytoscape進行運算的插件[16]，利用軟件中的Degree算法來篩選一個網絡中的樞紐基因。本研究設置樞紐基因個數為10，并利用Cytoscape 3.6.1軟件將共表達網絡可視化[17]。

2 結果與分析

2.1 表達差異的lncRNA和mRNA

為建立基因共表達網絡，選取18個樣本的轉錄組測序數據，使用R進行標準化預處理。R包注釋用來匹配探針到基因symbol，匹配到多個基因的探針被去除，一個基因匹配到多個探針的，中值作為最終的表達值。剔除不同樣本中FPKM值小于1的mRNA和lncRNA，最終得到4139條mRNAs和322條lncRNAs。

2.2 共表達網絡分析

共表達分析包括18個樣本和11個脂肪酸組成性狀。利用R中的“WGCNA”包，通過平均連鎖層次聚類將表達模式相似的差異基因劃分為一個模塊。選擇β＝7作為軟閾值，以保證構建無尺度網絡。設置模塊最少基因數為30，劃分為15個模塊（圖1）。

根據基因表達模塊的表達趨勢與脂肪酸組成的變化趨勢進行相關性分析（圖2）。MEturquoise模塊與硬脂酸呈顯著正相關（r＝0.58，P＝0.01）；MEgreenyellow模塊與亞油酸呈極顯著負相關（r＝-0.73，P＝ 0.0005），與多不飽和脂肪酸呈顯著正相關（r＝0.55，P＝0.02）；亞麻酸與MEyellow模塊呈顯著負相關（r＝-0.65，P＝0.004），與MEbrown和MEgreen模塊均呈顯著正相關（r＝0.56，P＝0.01；r＝0.63，P＝0.005）；花生酸分別與MEblue、MEpurple和MEblack模塊呈顯著負相關（r＝-0.55，P＝0.02；r＝-0.56，P＝0.02；r＝-0.52，P＝0.03），與MEturquoise、MEgreen、MEtan和MEmagenta模塊呈極顯著負相關（r＝-0.63，P＝0.005；r＝-0.73，P＝0.0006；r＝-0.72，P＝0.03；r＝-0.60，P＝0.009），與MEyellow模塊呈顯著正相關（r＝0.5，P＝0.03）；花生酸-烯酸與MEturquoise模塊呈顯著負相關（r＝-0.57，P＝0.01），單不飽和脂肪酸與MEred模塊呈顯著正相關（r＝0.54，P＝0.02）。

2.3 富集分析

通過比較模塊與脂肪酸組成的相關性，選擇MEgreen模塊和MEyellow模塊進行深入分析。通過ClueGO的kappa分數統計方法，計算基因生物學過程、通路以及mRNA的關聯性，分別構建2個模塊的生物學功能和通路的互作網絡。從圖3可以看出，MEgreen模塊基因顯著富集于線粒體ATP合成偶聯電子傳遞過程、基于酰基輔酶A脫氫酶脂肪酸β氧化、脂肪酸分解代謝過程等生物學過程，以及顯著富集于氧化磷酸化、脂肪酸降解、PPAR信號通路等。

由圖4可知，MEyellow模塊基因顯著富集于脂肪酸生物合成過程、脂肪酸β氧化過程和糖原生物合成過程等生物學過程，并且顯著富集于氧化磷酸化、生熱相關信號通路以及PPAR信號通路等。根據富集結果可以發現，2個模塊中的基因與脂肪酸組成性狀相關，但MEgreen模塊基因功能側重于脂肪酸分解過程，MEyellow模塊基因側重于脂肪酸合成等生物過程。

2.4 構建共表達網絡

對所有模塊進行富集分析后，發現MEgreen模塊和MEyellow模塊中的基因顯著富集于與脂肪酸組成有關的信號通路。相關性分析表明，2個模塊與亞麻酸、花生酸含量等有顯著相關關系，因此，對MEgreen模塊和MEyellow模塊進行分析。使用軟件Cytoscape 3.6.1對這2個模塊中的網絡關系可視化（圖5），基于cytoHubba插件找出網絡中的重要節點。在每個網絡中篩選出10個核心基因，其中MEgreen模塊有7個lncRNAs，126個mRNAs，核心基因為NADH脫氫酶1β亞復合物3（NDUFB3）、NADH脫氫酶1β亞復合物7（NDUFB7）、NADH：泛醌氧化還原酶亞基AB1（NDUFAB1）、卟啉原氧化酶（CPOX）、NADH：泛素氧化還原酶核心亞基V1（NDUFV1）、ATP合酶F1亞基（ATP5A1）、肉毒堿棕櫚酰轉移酶2（CPT2）、ATP合酶外周莖亞基OSCP（ATP5O）、線粒體RRNA甲基轉移酶（MRM1）和電子轉移黃蛋白亞基α（ETFA）。

同樣的方法，對MEyellow模塊進行分析（圖6），其中有9個lncRNAs，156個mRNAs，核心基因為肌肉相關的糖原磷酸化酶（PYGM）、泛素結合酶E2 D4（UBE2D4）、磷酸甘油酸酯變位酶2（PGAM2）、脯氨酸-絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶相互作用蛋白2（PSTPIP2）和葡萄糖磷酸變位酶1（PGM1）、包含E3泛素蛋白連接酶的WW結構域1（WWP1）、包含5A的DENN域（DENND5A）、肌動蛋白相關蛋白1B（ACTR1B）、單ADP核糖水解酶1（MACROD1）和Cullin締合類泛素化酶解離2（CAND2）。

3 結論與討論

本研究采用WGCNA方法，通過表達特性對mRNA、lncRNA進行模塊聚類分析。與通常根據差異性和表達量篩選候選基因的方法不同[18]，WGCNA根據基因表達特征進行歸類，再通過互作網絡的連通度篩選基因，保留了潛在的新調控因子。從組學大數據整體視角，獲得了與脂肪酸組成相關的調控網絡，并篩選模塊中的關鍵分子。

通過構建共表達網絡，分別從MEgreen模塊和MEyellow模塊篩選到10個核心基因和若干個lncRNAs。其中，NDUFAB1、NDUFV1、CPT2和ATP5O等均是MEgreen模塊的關鍵基因。NDUFAB1可能是通過增強線粒體新陳代謝來預防肥胖和胰島素抵抗的線粒體靶標[19]。NDUFV1是涉及氧化應激和ATP產生的重要亞基，可為母豬腹中胎兒發育提供能量[20]。CPT2被運輸到線粒體內膜，與肉堿棕櫚基轉移酶I一起，編碼的蛋白質可使線粒體中的長鏈脂肪酸氧化[21]。CPT2下調可使肝細胞癌適應脂類豐富的環境，并通過肥胖中的酰基肉堿積累促進其發生癌變[22]。ATP5O作為氧化磷酸化相關的酶基因，可能通過上調LncRNAROR促進人脂肪間充質干細胞向褐色脂肪細胞分化[23]。WWP1、PSTPIP2、PGAM2和PGM1等是MEyellow模塊中的關鍵基因，通過功能富集發現，該模塊在氧化磷酸化、脂肪酸代謝等功能通路具有重要作用。PSTPIP2是一種與自身炎性疾病相關的蛋白，它參與巨噬細胞的活化、嗜中性粒細胞的運動和破骨細胞的分化等作用[24]。PGAM2位于線粒體中，參與氧化磷酸化作用[25]。PGM1對肥胖有一定的作用[26]。KOBAYASHI等[27]通過過表達與敲低等細胞試驗證明，WWP1對脂肪細胞中的氧化應激具有保護作用。大量的lncRNA被發現在發育過程中發揮著不可或缺的作用。本研究基于WGCNA方法分別從MEgreen、MEyellow模塊篩選得到7條和9條lncRNAs。這些lncRNA在豬肌肉脂肪酸組成中的作用機制還有待進一步驗證。

本研究利用R語言包“WGCNA”對轉錄組數據和脂肪酸組成數據相結合，是目前比較流行的數據分析手段。一些疾病的臨床數據研究都集中于利用WGCNA方法，發現了很多與胃癌[28]和阿爾茲海默癥[29]等疾病檢測、發展、治療的靶點，具有很高的應用價值。而在動物科學研究中，采用WGCNA方法篩選影響生產性能的關鍵分子的研究還很少。本研究采用WGCNA方法構建了與豬肌肉脂肪酸組成有關的調控網絡，發掘影響豬肌肉品質的關鍵分子。但還存在很多不足，這些關鍵mRNA以及lncRNA對豬肌肉脂肪酸組成的具體分子機制還有待驗證。

本研究采用WGCNA方法對2個品種豬的肌肉轉錄組數據進行分析，構建了2個共表達網絡，篩選了20條關鍵mRNAs和16條lncRNAs。發現關鍵基因中的NDUFAB1、ATP5A1和NDUFB7等基因主要在線粒體上參與氧化磷酸化過程，對豬肌肉脂肪酸組成有重要作用。本研究結果可為豬品質形成的分子機制研究提供理論參考。