ARR21基因在擬南芥生長發育和離體再生過程中的功能分析

衛云豐，張樹偉，程金金，王興春

（1.山西農業大學生命科學學院，山西太谷030801；2.山西農業大學農學院，山西太谷030801）

細胞分裂素是五大經典激素之一，在植物生長發育、脅迫響應和離體再生等諸多過程中起著極其重要的調控作用[1-8]。在過去的20多年中，科學家利用模式植物擬南芥系統研究了細胞分裂素的生物合成、轉運及信號轉導過程。在擬南芥中發現了3種組蛋白激酶（Arabidopsis histidine kinases，AHKs）為細胞分裂素受體，分別為AHK2、AHK3和AHK4[3，9]，這些受體通過磷酸化的方式將細胞分裂素信號經組氨酸磷酸轉移蛋白（Arabidopsis histidine-phosphot transfer proteins，AHPs）傳遞至B型應答調節因子（Arabidopsis response regulators，ARRs）[4-6]。B-ARRs作為一型MYB蛋白，其N端信號區含有天冬氨酸（D）、天冬氨酸（D）和賴氨酸（K）3個保守的氨基酸殘基，該結構也被稱為DDK結構域，該結構域的第2個天冬氨酸具有接受磷酸基團的功能[3，9-10]。B-ARRs的DDK結構域接收到上游AHP傳遞來的磷酸基團后，被磷酸化激活，從而啟動包括A-ARRs在內的下游靶基因的轉錄，進而調節植物的生長發育[3，9-12]。

擬南芥中共編碼12個B-ARR，N端均有1個保 守 的 信 號 接 收 域（Receiver domain，RD），除ARR23外C端均含有典型的MYB類轉錄因子結構域（GARP）[13]。有研究發現，單突變體arr1、arr2、arr10、arr11和arr18等與野生型均無明顯的表型差異，而arr10/12雙突變體對細胞分裂素的響應變弱，arr1/10/12三突變體完全喪失了對細胞分裂素的響應且植株矮小[14]，表明B-ARRs基因家族存在功能冗余[13]。進一步研究發現，B-ARRs的N端信號區的DDK結構域對C端轉錄激活區具有抑制作用，而過表達DDK結構域缺失突變基因（ΔDDK）會解除轉錄抑制，導致B-ARRs介導的細胞分裂素信號途徑組成型激活，從而使轉基因植物呈現典型的細胞分裂素表型[10，15-17]。

ARR21作為B型ARR家族中的一員，與ARR13具有較高的相似性[16]，但其功能尚待深入研究。本試驗利用雌激素誘導表達系統和T-DNA插入突變體研究了ARR21基因表達對擬南芥幼苗生長發育和離體再生的影響，旨在為深入解析ARR21基因的功能奠定基礎，為利用ARR21基因提高植物離體再生和遺傳轉化效率奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

研究用的野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana）為Columbia-0（Col-0）。載體為pER10和pER8[18]。T-DNA插入突變體arr13（SALK_042719c）和arr21（SALK_005772c）由陳受宜研究員饋贈。arr13/21雙突變體由arr13和arr21單突變體雜交獲得。擬南芥播種在1/2 MS培養基上，培養條件為：光周期16 h光/8 h暗，光照強度80～120μmol/（m2·s），溫度22℃。

1/2 MS培養基：2.3 g/LMurashige and Skoog Basal Medium w/Vitamins（PhytoTechnology Laboratories，貨號M519）、2%蔗糖和0.8%的瓊脂粉，pH值5.8。

雌激素誘導培養基為1/2 MS培養基添加10μmol/L的17-β雌二醇（Sigma，貨號E8875）。

1.2 試驗方法

1.2.1 擬南芥B-ARRs進化關系分析 從擬南芥的基因組數據庫TAIR（www.arabidopsis.org）中獲得B型ARR家族12個成員序列，利用MEGA 7.0軟件構建系統進化樹，Bootstrap參數設置為1000。

1.2.2ARR21基因過量表達載體的構建和擬南芥遺傳轉化 以Col-0基因組DNA作為模板，利用東洋紡（上海）生物科技有限公司的高保真DNA聚合酶KOD-plus v2以及引物ARR21XhoI和ARR21XbaI（表1）擴增ARR21，經XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切后連接pER8載體，構建雌激素誘導的pER8-ARR21過量表達載體。PCR擴增體系為DNA模板3μL，dNTP 5μL，MgSO43μL，上下游引物各1.5μL，DNA聚合酶5μL，10×Buffer 5μL。擴增程序為：94℃2 min；94℃10 s，55℃30 s，68℃1 min，30個循環；68℃10 min，4℃保存。

利用ARR21ΔDDKXhoⅠ和ARR21XbaⅠ引物擴增缺失5′端438 bp（146個氨基酸）的ARR21基因，即ARR21ΔDDK片段。將該片段利用XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切后連接雌激素誘導表達載體pER10，構建成pER10-ARR21ΔDDK載體。PCR擴增體系和擴增程序同上。

表1 引物序列

將pER8-ARR21載體及pER10-ARR21ΔDDK載體通過電激法轉入農桿菌GV3101中，并利用農桿菌介導的花序浸染法[19]將其轉入Col-0野生型中；進行轉化后，將獲得的擬南芥種子種植于篩選培養基中，并施加篩選壓力，篩選符合3∶1分離比的抗性擬南芥植株，獲得轉化成功突變體。

1.2.3 RNA提取和實時定量PCR反應 擬南芥總RNA的提取、cDNA第1鏈合成和實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）均采用寶日醫生物技術（北京）有限公司的試劑盒。其中，RNA提取采用柱式法植物RNA小量提取試劑盒（貨號9769），cDNA第1鏈合成采用PrimeScriptTMRT reagent Kit（貨號RR047A），RT-qPCR采用TB GreenRPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒（貨號RR820A），所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。RT-qPCR所用的ARR21基因特異引物為ARR21qF和ARR21qR，內參基因ACTIN7（AT5G09810）的引物為ACT7qF和ACT7qR。采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.2.4 擬南芥離體再生 擬南芥離體再生試驗以弱光下培養的下胚軸為外植體，采用兩步法進行[20]。

2 結果與分析

2.1 ARR21基因的系統進化分析

擬南芥基因組中共有12個B-ARRs基因，分別為ARR1、ARR2、ARR10、ARR11、ARR12、ARR13、ARR14、ARR18、ARR19、ARR20、ARR21和ARR23。系統進化樹結果表明，12個B-ARRs聚為3個亞類，其 中，ARR1、ARR2、ARR10、ARR11、ARR12、ARR14和ARR18為第Ⅰ亞類，ARR13、ARR21和ARR23為第Ⅱ亞類，ARR19和ARR20為第Ⅲ亞類。其中，ARR23序列較短，僅有信號接收域RD，無MYB結合域（GRAP）（圖1-A），同一亞類中的ARR13和ARR21親緣關系較近（圖1-B），預測其可能具有相同或相似的功能。

2.2 過量表達擬南芥ARR21基因對幼苗生長發育的影響

為了研究ARR21基因在擬南芥生長和發育過程中的功能，構建了ARR21基因過量表達擬南芥pER8-ARR21（圖2-A），在MS培養基和雌激素誘導培養基生長情況結果顯示，過表達植株在無誘導劑的培養基上均生長良好，而在雌激素誘導培養基上生長發育嚴重受阻。其中，24號株系長出真葉，生長發育受阻較輕（圖2-C）；14號和31號株系生長發育受阻較重，且31號受阻表型最為嚴重，根系較短，且沒有真葉長出（圖2-B、D）。RT-qPCR結果表明，野生型擬南芥中ARR21基因幾乎不表達，而在過表達的轉基因擬南芥中，24號植株的表達量最低，31號株系中表達量最高，這與其生長發育受阻表型是一致的（圖2-E）。由此預測，ARR21基因過量表達抑制了擬南芥的生長發育。

2.3 ARR21信號接收域缺失對其功能的影響

B-ARRN端含有負調控功能的DDK結構域。為研究該結構域的功能，構建了刪除N端160個氨基酸殘基的雌激素誘導表達載體pER10-ARR21ΔDDK，結果顯示，與pER8-ARR21轉基因幼苗表現一致，過量表達缺失信號接收域的ARR21ΔDDK基因抑制了擬南芥幼苗的生長發育（圖3-A、B），且這種生長發育抑制表型與ARR21ΔDDK基因的表達量相關（圖3-C）。

2.4 ARR21基因功能缺失對擬南芥生長發育的影響

為了進一步了解ARR21基因在擬南芥生長發育過程中的功能，研究了ARR21功能缺失突變體arr21的表型，在arr21突變體中，T-DNA插入在第5個外顯子中，導致該基因功能完全喪失（圖4-A）。在本試驗條件下，arr21突變體與Col-0野生型無明顯差異，表明ARR21基因功能缺失對擬南芥生長發育無影響（圖4-B、C）。由于ARR21基因與ARR13基因有較高的相似性（82%），可能存在功能冗余。為此，進一步分析了arr13及arr13/21雙突變體的表型，結果表明，arr13和arr13/21突變體幼苗與野生型Col-0也無明顯差異（圖4-D、E）。

2.5 擬南芥ARR21基因過表達和缺失對離體再生的影響

細胞分裂素在植物離體器官再生過程中起著極其重要的作用，進一步分析了ARR21基因過表達和功能缺失對擬南芥離體再生的影響，結果顯示（圖5），過表達ARR21基因顯著提高了離體再生能力，但arr21功能缺失對離體再生無顯著影響；此外，arr13單突變體和arr13/21雙突變體離體再生效率均低于野生型。

3 結論與討論

B-ARR為細胞分裂素信號途徑的關鍵樞紐，探究其生物學功能對于闡明細胞分裂素途徑的調控機制有重要意義。擬南芥基因組中共編碼12個B-ARRs，其中，ARR1、ARR10、ARR12等的功能已有了清晰的認識[5]。本研究表明，B型ARR基因ARR21過量表達抑制了幼苗的生長發育，促進了離體再生；雖然arr21單突變體對離體再生無顯著影響，但arr13/21雙突變體離體再生能力低于野生型。

有研究發現，由于DDK結構域對C端轉錄激活域的抑制，組成型表達DDK結構域缺失的B型ARR基因會導致細胞分裂素信號激活，抑制幼苗生長發育，導致難以獲得轉基因后代[10，15-18，21]。本研究發現，過表達DDK缺失突變體在雌激素誘導培養基上，幼苗生長發育異常，無法收獲轉基因種子，與前人對組成型表達ARR21ΔDDK的研究結果完全一致。值得注意的是，該結果與過量表達ARR21全長基因的研究結果相似，二者突變體幼苗均出現典型的細胞分裂素表型，即幼苗生長發育嚴重受阻[15]；盡管如此，arr21單突變體和arr13/21雙突變體幼苗生長發育完全正常，推測ARR21基因可能不參與營養生長階段的調控，這與其表達譜一致[13]。

細胞分裂素是植物離體器官再生的關鍵決定因素。本研究發現，arr21單基因突變對擬南芥離體再生無顯著影響，而arr13/21雙基因突變后離體再生效率顯著降低，表明B型ARR參與調控擬南芥離體再生，且存在明顯的功能冗余；相反，結構缺失導致的ARR21基因組成型表達可以顯著提高離體再生效率。因此，ARR21基因有望用于難以組培的植物，以提高其遺傳轉化效率。

本研究初步解析了ARR21基因在植物生長發育和離體再生過程中的功能，但其具體調控機制有待進一步研究。隨著高通量測序技術的發展，未來可以利用基于高通量測序的ChIP-Seq等技術，篩選和鑒定ARR21的下游靶基因，闡明其轉錄調控機制。