椰漿中椰子蛋白的提取、分離和鑒定

林塬 吳毓煒 王焱 吉哲蓉 樂學義

摘? 要：為了更好地了解市售椰漿中椰子蛋白質量狀況，本研究以市售的10種椰漿為樣品，采用反向高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）及十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium laurylsulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）對提取蛋白進行分析，采用基質輔助激光解吸電離飛行時間串聯質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF-MS）對蛋白進行鑒定。結果表明：椰漿RP-HPLC約在10.4 min和11.9 min分別出現1個色譜峰，大多數樣品峰面積大小都與蛋白標簽含量一致，SDS-PAGE條帶數量和顏色的深淺與RP-HPLC得到的峰面積結果一致，個別樣品標簽含量高，SDS-PAGE能分離出的蛋白條帶數量也較多，但RP-HPLC的椰子蛋白峰面積小，經MALDI-TOF/TOF-MS鑒定，部分條帶沒有鑒定出椰子有關的肽段或蛋白。研究結果為椰漿蛋白的食品安全與質量控制提供了方法參考和示范。

關鍵詞：椰漿;蛋白分析;鑒定;RP-HPLC;SDS-PAGE;MALDI-TOF/TOF-MS

中圖分類號：S667.4? ? ? 文獻標識碼：A

Extraction， Isolation and Identification of Coconut Protein from Coconut Milk

LIN Yuan1， 2， WU Yuwei2， WANG Yan2， JI Zherong2， LE Xueyi1*

1. Department of Applied Chemistry， South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510642， China; 2. Products Quality Supervision and Testing Institute of Hainan Province / National Quality Supervision and Inspection Center for Tropical Agriculture Products， Haikou， Hainan 570203， China

Abstract： In order to better understand the quality of coconut protein in commercially available coconut milk， 10 types of coconut milk were used as the samples bought from the market. Reversed-phase high performance liquid chromatography （RP-HPLC） and sodium laurylsulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE） were used to analyze the extracted proteins， identified through matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrometry （MALDI-TOF/TOF-MS）. There were two peaks in RP-HPLC of coconut milk at 10.4 min and 11.9 min， the peak area of most samples were consistent with the protein label content. The number of SDS-PAGE bands and intensity were consistent with the peak area results obtained by RP-HPLC. Some samples had high label content， and SDS-PAGE could separate more protein bands， but the peak area of coconut protein from RP-HPLC was small. The protein bands were identified with MALDI-TOF/TOF-MS and no coconut-related peptides or proteins were identified. This method could be used for the isolation and identification of coconut protein in coconut milk.

Keywords： coconut milk; protein analysis; identification; RP-HPLC; SDS-PAGE; MALDI-TOF/TOF-MS

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.029

椰子（Cocos nucifera L.）是棕櫚科（Palmae）椰子屬（Cocos）植物[1]，是世界上重要的果樹之一[2]。椰肉富含蛋白，易于被人體吸收，有較好的保健效果，如具有抗糖尿病活性[3]、抗氧化活性[4]和降低血脂[5]等作用，近年來引起了人們的興趣[6]。椰子肉中蛋白質的種類包括球蛋白、谷蛋白、白蛋白和醇溶蛋白等[7]。椰子全身是寶，但其可食部分比例較小、加工麻煩，不宜直接將其作為生產原料。椰子果肉被加工成純椰漿，在保持其營養物質和天然風味的同時解決了運輸麻煩的問題，降低貯存費用，便于廣泛使用。

椰漿目前的研究主要集中在揮發性風味成分及脂肪酸的類型和含量[8]、濃縮方法（常壓、真空）對椰漿各指標的影響[9]、真空濃縮椰漿的護色工藝[10]和真空濃縮椰漿形成穩定乳狀液的乳化劑配比[11]等。椰子中蛋白質的分離和鑒定研究很少，1930年美國科學家從椰子蛋白質中分離出一種分子量約208 kDa的球蛋白，并命名為Cocosin[12]。Hagenmaier等[13]采用Sephadex G-200層析方法對椰子蛋白進行了分析，發現3個蛋白質峰。Huang等[14]采用雙向電泳（2-DE）技術對椰子蛋白進行了分析，通過MS/MS鑒定出7S球蛋白、一種類似于谷蛋白和受體樣蛋白激酶的蛋白質。椰子蛋白含有人體所需的氨基酸，通過椰子蛋白的分析方法還可分離出椰子蛋白并測定其氨基酸含量[15-16]。

椰子蛋白的含量與其品種、生長環境等有關，在生產椰漿的過程中為保證椰漿中蛋白質的含量，可能會加入其他蛋白質。椰漿的內控要求中，蛋白質含量是一項重要的指標，目前用于測定蛋白質的方法是GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法，該方法是一種測定蛋白質的經典方法，具有廣泛性、操作相對簡單、實驗成本低和準確性高等優點，缺點是測定結果為總有機氮，只要是含氮的物質，都被當成蛋白質計入結果，不能準確評定椰漿質量。本研究以反應后的椰子蛋白的RP-HPLC、SDS-PAGE以及MALDI-TOF MS的鑒定結果為評價指標，研究椰漿蛋白的定性分析方法，旨在為椰漿蛋白的食品安全與質量控制提供方法參考和示范。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料與試劑? 供試椰子為海南綠色高種（Cocos nucifera L.， Hainan Tall， green fruit），老椰子，市售10種椰漿樣品信息見表1。

乙腈和三氟乙酸，色譜純，美國Tedia公司;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、三羥甲基氨基甲烷、氨基乙酸、十二烷基硫酸鈉、丙烯酰胺、過硫酸銨及溴酚藍，均為分析純，廣州化學試劑廠;考馬斯藍（分析純），國藥集團化學試劑有限公司;水為超純水。

蛋白提取液：取磷酸氫二鉀5.5 g與磷酸二氫鉀0.41 g，加超純水溶解并將pH調到8.0，最后定容至1000 mL為堿提取液。

1.1.2? 儀器與設備? Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、Sigma 3-18K冷凍高速離心機（德國Sigma公司）、Mini-protea Tetra system蛋白電泳儀（美國Bio-rad公司）、超純水系統（美國Millipore公司）、S20K型pH計（瑞士梅特勒-托利公司）、5800MALDI基質輔助激光解吸電離飛行時間串聯質譜（美國AB SCIEX公司）、ZM200高速粉碎機（德國Retsch公司）。

1.2? 方法

1.2.1? 樣品制備及提取? 鮮榨椰子漿：椰子去掉椰衣后取出椰子肉，去褐色種皮，用粉碎機粉碎成椰子肉泥（粉碎機上安裝1 mm的篩），將殘渣過濾后取濾液為椰漿。總蛋白的提取參照文獻[17]中的方法，略有改動。稱取椰漿4 g，加入蛋白提取液40 mL，4 ℃水浴中磁力攪拌提取0.5 h后，4 ℃、6000 r/min離心15 min，去掉上層油脂及底層沉淀，取中間層澄清液，將澄清液pH調至蛋白質等電點即pH 3.5，4 ℃、6000 r/min離心15 min，棄掉上清液，用超純水清洗沉淀3次，加入5 mL提取液溶解蛋白，4 ℃冷藏備用。

1.2.2? 液相色譜分離條件? 流動相A為含有體積分數0.1%三氟乙酸的乙腈溶液，流動相B為含有體積分數0.07%三氟乙酸的超純水，色譜柱為Agilent PLRP-S（300A，8 μm，250 mm×4.6 mm），檢測波長214 nm，流速為1 mL/min，進樣體積10 μL，柱溫24 ℃。經過反復多次的試驗，最終采用線性梯度洗脫程序為：開始1～2 min，34% A;2～4 min，34%～37% A;4～8 min，37%～42% A;8～10 min，42%～45% A;10～11 min，45%～42% A;11～13 min，42%～38% A;13～15 min，38%～34% A。此條件下，色譜峰峰形好且得到有效的分離。

1.2.3? SDS-PAGE蛋白電泳條件? 椰子蛋白的SDS-PAGE分析參照文獻[18]的方法，SDS-PAGE分離膠的濃度為12.5%，濃縮膠的濃度為4%。在進行電泳試驗時先恒定功率在5 W/膠，約1 h后蛋白條帶從濃縮膠進入到分離膠，再將功率恒定在10 W/膠直至電泳結束。用考馬斯亮藍G-250染色，先用10%乙酸脫色，再用5%乙酸脫色，最后用水去除凝膠上的染色背景，然后掃描凝膠。

1.2.4? MALDI-TOF/TOF-MS條件? MALDI- TOF/TOF-MS分析參照文獻[19]中的方法，從凝膠上挖取對應的蛋白條帶，然后加100 μL超純水洗15 min，去除水，用移液槍頭將蛋白條帶搗碎，利于后期酶與蛋白充分接觸，提高酶切效率。加入100 μL脫色液—[50% 100 mmol/L碳酸銨（NH4）2CO3，50% 乙腈ACN]，置于搖床振蕩30 min。加入100 μL 100% ACN，搖床振蕩脫水10 min，重復該步驟2次至膠粒變為純白色。開蓋，除去ACN，置超凈臺中干燥，直至ACN完全揮發，小心將離心管蓋扣好，防止干膠粒蹦出。根據膠粒大小加入3～5 μL胰酶（20 ng/μL酶液），以完全覆蓋膠粒為佳，蓋好置于冰浴約1 h，使膠粒充分吸收酶液。根據膠粒大小，加入5～8 μL胰酶緩沖液，以覆蓋膠粒為佳，在PCR儀（熱蓋設置為100 ℃左右，防止樣品蒸發）37 ℃酶解16 h。酶解結束后先加入0.8 μL酶解液到質譜靶上，近干后加入0.8 μL酶解液，待其近干再加入0.8 μL基質（濃度5 mg/mL），待其完全干后即可進行質譜鑒定。

將所得到的質譜信息通過MASCOT 2.2軟件以植物界的分類法（綠色植物，包括6 686 534個序列）為基礎，在美國國立生物技術信息中心（NCBI）數據庫（發布版本NCBI prot 20180429，包括152 462 470個序列和55 858 910 152個殘基）進行檢索。MASCOT軟件搜索參數如下，搜索類型：MS/MS離子搜索;酶：胰蛋白酶/ P;固定修飾：脲基（C）;可變修飾：氧化（M）;質量值：同位素;蛋白質量：不受限制;肽質量公差：±300×10?6;碎片質量公差：±0.3 Da;最大錯位：1;查詢數量：158。

2? 結果與分析

2.1? 椰漿的液相色譜分析

椰漿提取蛋白經液相色譜分析，在10.3 min和11.9 min分別有1個峰。此次分析的椰漿樣品分別來自中國海南、泰國、馬來西亞、印度尼西亞，椰漿中蛋白含量范圍為0.9～3.3 g/100 mL（表1）。從圖1可知，除5號和6號樣品外，其余椰漿蛋白的2個色譜峰面積之和與產品標識的蛋白含量基本呈正相關;1號樣品的蛋白質含量最大（2.0 g/100 mL），色譜峰面積之和也是最大。

5號和6號樣品的液相色譜圖見圖2，椰漿蛋白液相色譜峰面積之和表現出與產品標識的蛋白含量結果不一致。其中，6號樣品的蛋白質含量為3.3 g/100 mL，2個色譜峰的峰面積都與3號樣（蛋白含量為0.9 g/100 mL）的峰面積相差不大。結果表明，除去實驗帶來的誤差，5號和6號樣品中的蛋白質含量與標簽中蛋白含量不符，標簽的蛋白含量可能由凱氏定氮法測得，但這種氮并非椰漿蛋白質中的氮。

11號樣品為海南本地企業送檢樣，與鮮榨椰子漿（12號樣品）液相色譜圖結果最為相近（圖2C、圖2D）。3次平行樣的平均峰面積詳見表2。圖2A中5號椰漿液相色譜峰的保留時間分別為10.479 min和12.024 min，與圖2D中鮮榨椰子漿提取的蛋白溶液色譜圖峰型相似，但低濃度椰漿的2個色譜峰的出峰時間都推后了約0.5 min，如果以第1個峰為分子、第2個峰為分母，計算相對保留時間，獲得椰漿的相對保留時間為1.14 min，鮮榨椰子汁的相對保留時間為1.15 min，相對保留時間差為0.01 min，這可能是由于蛋白質的濃度不同、椰漿的處理工藝不同或是在椰漿生產過程中加入了不同添加劑而導致的結果。

2.2? 椰漿電泳圖

椰漿的電泳圖條帶少且顏色淺。在中國海南和泰國產的椰漿樣品1～7號中，除6號樣品外，其他樣品的電泳圖都較為相似，6號樣品因蛋白濃度高，電泳圖條帶比其他樣品的條帶清楚，且6號電泳圖在19～26 kDa之間比其他椰漿多了1條條帶（圖3）。電泳結果表明，6號樣品中含有

一定量的蛋白質，與標簽含量一致，但這與液相色譜峰面積較小的結果不一致，可能是椰漿生產工藝中產生或是加入的蛋白。5號樣品的電泳條帶少且顏色淺，這與液相色譜峰面積小的結果一致，與標簽含量不一致。8～10號椰漿為馬來西亞的椰漿，這3個樣品的電泳條帶個數基本一致，但各個條帶深淺有區別，說明含有的蛋白種類基本相同但是含量有所差異。

2.3? MALDI-TOF/TOF-MS鑒定結果

從凝膠上挖取具有代表性的蛋白條帶（挖點見圖3），用MALDI-TOF/TOF-MS進行鑒定，根據Mascot （http：//www.matrixscience.com）搜索，椰漿的9個挖點中有6條蛋白條帶均鑒定出vicilin-like antimicrobial peptides 2-1， partial [Elaeis guineensis]（豌豆球蛋白樣抗菌肽2-1，部分[油棕]）。MALDI-TOF/TOF-MS圖見圖4，圖中標出特征肽段QQPFYDEGMR（分子量1270.59）的二級圖譜，條帶2、3、6、7、8都鑒定出豌豆球蛋白樣抗菌肽2-1，部分[油棕]，這些條帶的MALDI-TOF/TOF-MS圖譜與條帶1的相似。根據質譜鑒定出的氨基酸序列，通過Swiss-modle（https：//swissmodel.expasy.org/inte ractive）數據比對，得到許多同源序列，選定相關性最高的作為待測蛋白質列模板，與63 kDa 類球蛋白的條帶具有最高相關性的模板為豌豆球蛋白模板（4lej.1.A），相似性為37.50%～38.81%，63 kDa 類球蛋白也是椰子中的高豐度蛋白，含量較高[20]。

由圖3的條帶9鑒定出3種蛋白，除了63 kDa類球蛋白[油棕]外，還鑒定出7S球蛋白[油

棕]和11S球蛋白同種型1[椰子]，MALDI-TOF/ TOF-MS圖譜見圖5。圖中標出了7S球蛋白[油棕]：EEVFMAGPEER（分子量 1293.622）、11S球蛋白同種型1[椰子]：GDEVAIFTPR（分子量1104.604）和63 kDa類球蛋白[油棕]：VAIIETNP NT FVLPSHFD AEA LL FVAR（分子量2984.696）代表性的特征肽段，鑒定結果見表3。椰漿中鑒定出的7S和11S球蛋白，與文獻報道結果一致[21]。

椰漿的電泳圖基本都有的3個條帶，分別為26 kDa、35～49 kDa和49 kDa。6、8、9、10號椰漿電泳圖上26 kDa的條帶比鮮榨椰子漿中的蛋白條帶深，6號樣品的條帶3和8號樣品的條帶8均鑒定為豌豆球蛋白樣抗菌肽2-1，可能是由于椰漿的生產工藝使得蛋白質分解成多肽而產生了此條帶的蛋白。所有椰漿35～49 kDa之間的條帶和49 kDa的條帶都比鮮榨椰子漿的條帶淺，可能是由于椰漿生產加工過程中，部分蛋白因理化因素發生了變性而析出，導致蛋白質濃度下降。6號樣品的第4和第5條條帶，沒有鑒定出椰子相關的肽段或蛋白，這與高效液相色譜峰面積小的結果一致，可推測出6號椰漿樣品加入非椰子蛋白的概率大。

3? 討論

椰漿用途廣泛，可作為食品添加劑，椰子果肉被加工成椰漿，可保持其營養物質和天然風味。椰漿的9個挖點中有6條蛋白條帶鑒定出vicilin-like antimicrobial peptides 2-1，partial [Elaeis guineensis]（豌豆球蛋白樣抗菌肽2-1，部分[油棕]）：QQPFYDEGMR（分子量1270.59）。Zheng等分別于2016、2019年從椰餅分離蛋白水解物中分離出2條抗氧化肽Pro-Gln-Phe-Tyr-Trp（865.02 Da）、ArgPro-Glu-Ile-Val（612.36 Da）[22]和具有ACE抑制和抗氧化作用的3條活性肽KAQYPYV、KIIIYN和KILIYG[23]。這些結果表明，椰子蛋白是一種具有生物活性肽的潛在來源。

通常用于植物蛋白的分析方法有十二烷基凝膠電泳（SDS-PAGE）、高效液相色譜（HPLC）和基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI- TOF/TOF-MS）等。MALDI-TOF/TOF-MS因具有高通量、高分辨率、低檢測線和準確性，更適用于植物蛋白的定性分析。本研究以RP-HPLC得到的色譜峰面積和SDS-PAGE條帶數量和顏色的深淺相互驗證，并與MALDI-TOF/TOF-MS鑒定出的肽段根據Mascot搜索匹配的蛋白質的信息為評價指標，研究了椰漿中椰子蛋白的定性分析方法，可初步判定椰漿蛋白與產品標識是否相符，判斷椰漿蛋白是否來源于椰子蛋白，可作為椰漿中摻入非椰子蛋白的有效鑒定方法，具有廣闊的應用空間，為椰漿蛋白的食品安全和質量控制提供了方法參考和示范。

在椰漿和鮮榨椰子漿的HPLC圖中，都有2個明顯的色譜峰，特別是在鮮榨椰子漿中，這2個色譜峰的峰面積更大。在今后的研究中，可研究批量分離純化這2個蛋白色譜峰的方法，明確這2種椰子蛋白物理化學性質;椰子蛋白有促進健康和預防疾病的潛力，可采用已有的現代生物學技術開發出這2種椰子蛋白更多的附加值，在生產椰子蛋白質產品時，通過加酸、堿、酶等，得到更容易消化且功能性更好的椰子蛋白質產品;也可將這2種純化后的椰子蛋白作為標準品，用HPLC外標法檢測和評價椰子產品蛋白含量，而不是只檢測氮含量，使得椰子蛋白的檢測更合理和簡化，對于椰子產品的應用與推廣都具有重要的意義。

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責任編輯：崔麗虹