微柱高效液相色譜法測定體液中降壓藥的含量

李金祥，李佳歡，唐曉妍

(遼寧師范大學化學化工學院，遼寧 大連 116000)

高血壓是中老年人群中常見的慢性疾病，也是心腦血管疾病的主要危險因素。根據(jù)2012年世界衛(wèi)生組織報告，全世界四分之一的成年人即大約11.3億成年人患有高血壓，并且中風和心臟病導致的死亡率為50%。因此，控制高血壓對于降低心血管疾病并發(fā)癥(如中風、心臟驟停、冠心病、充血性心力衰竭等)至關(guān)重要。為了減少心血管疾病、并發(fā)癥并避免死亡，目標是使患者的血壓低于 140/90 mmHg。

在高血壓的臨床治療中，單一用藥通常無法達到目標血壓，而是需要兩種或多種藥物共同作用，將具有不同作用機制的降壓藥聯(lián)合使用有助于達到目標血壓，同時這與單一藥物治療相比具有多個優(yōu)勢[1]。不同機制的藥物作用于人體，會使降壓效果更好，并改善治療的依從性。使用的劑量較低可以減少藥物的副作用，并且降低治療成本。

以往的文獻中報道了許多檢測體液中降壓藥含量的方法，如分光光度法、氣相色譜法、高效液相色譜法、親水作用色譜法、毛細管電色譜法等，其中高效液相色譜法最為常用。Khuroo等[2]建立了一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測器(LC-MS)的方法用來同時檢測血漿中的阿替洛爾和氯噻酮的含量，該方法的靈敏度和特異性適合于阿替洛爾和氯噻酮的臨床藥代動力學研究。Tabrizi等[3]利用熒光光譜法測定藥物制劑中的阿替洛爾和卡維地洛的含量。

但是并沒有查到利用微柱液相色譜同時分離和檢測氫氯噻嗪(HCT)、阿替洛爾(ATN)和利血平(RSP)三種降壓藥的方法。本研究建立了一種微柱液相色譜串聯(lián)紫外檢測器的方法用來同時分離和檢測血漿和尿液兩種基質(zhì)中HCT、ATN和RSP三種降壓藥。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器與試劑詳見表1、表2所示。

表1 實驗儀器

表2 試劑與材料

1.2 色譜柱的制備

以 5 μm 裸硅球為載體，甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)為單體，季戊四醇三丙烯酸酯(PETA)為交聯(lián)劑，甲醇與環(huán)己醇的混合溶液作為致孔劑，偶氮二異丁腈(AIBN)作為引發(fā)劑，在內(nèi)徑為 150 μm 的石英毛細管內(nèi)，以原位聚合的方式制備了硅膠顆粒擔載有機聚合物(GMA-co-PETA)的整體基質(zhì)。由于GMA本身帶有環(huán)氧活性基團，使環(huán)氧活性基團進一步與亞硫酸鈉溶液進行磺化反應，使擔載基質(zhì)表面帶有磺酸根離子(SO32-)，即制得親水性強陽離子交換整體柱，而整體柱的親水性則表現(xiàn)在SO32-和含有親水性基團-OH的交聯(lián)劑的使用。

1.3 生物樣品前處理

在分析生物樣品的過程中，對血漿和尿液等生物樣品的預處理非常重要，這可能直接影響分析的最終結(jié)果。目前生物樣品預處理方法包括液-液萃取[4]、固相萃取和蛋白質(zhì)沉淀法。本文采用對血漿和尿液進行液-液萃取法以獲得較為純凈的基質(zhì)。

1.4 血漿樣品前處理

準確移取 1 mL 血漿，向其中加入一定量HCT、ATN和RSP的標準樣品溶液，使得樣品質(zhì)量濃度為 12 μg/mL。在 8000 r/min 下離心 5 min。離心后將淡黃色上層物質(zhì)轉(zhuǎn)移至另一干凈容器中，向其中加入 500 μL 乙酸乙酯，混合均勻后靜置 15 min, 將上層溶液取出并蒸干，殘余物質(zhì)用乙腈溶解，過濾后備用。

1.5 尿液樣品前處理

準確移取 200 μL 尿液，向其中加入一定量HCT、ATN和RSP的標準樣品溶液，使得樣品質(zhì)量濃度為 12 μg/mL。再向其中加入 1 mL 乙腈，混合均勻后在 8000 r/min 下離心 10 min，將上層清液轉(zhuǎn)移至另一干凈容器中，過濾備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離條件的優(yōu)化

利用親水性強陽離子整體柱分離HCT、ATN和RSP三種降壓藥的原理為:當三種分析物在流動相的作用下進入色譜柱的過程中，三種分析物會發(fā)生不同程度的質(zhì)子化，并與固定相上SO32-產(chǎn)生靜電作用；根據(jù)三種分析物與固定相作用力和親水作用的不同從而實現(xiàn)分離。

為了獲得較好的分離效果，對流動相的組成、濃度、pH及有機添加劑的含量等實驗條件進行了優(yōu)化。最后獲得的分離最佳條件為:以Na2HPO4作為流動相，濃度為 50 mmol/L，pH=9.1，5%乙腈作為有機添加劑，在分離的最佳條件下獲得的色譜圖如圖1。

圖1 HCT、ATN和RSP對照品分離色譜圖

根據(jù)離子交換機理可以判斷分析物的出峰順序依次為HCT、ATN和RSP。因為在流動相pH=9.1的實驗條件下，HCT不發(fā)生質(zhì)子化，最先出峰，ATN和RSP發(fā)生質(zhì)子化，而RSP質(zhì)子化的程度更大即所帶正電荷更多，所以與固定相上負電荷之間的靜電作用更強，最后出峰。該出峰順序與單一對照品進樣獲得的出峰順序一致。

2.2 血漿基質(zhì)中的分離

在最佳的分離條件下，將HCT、ATN和RSP三種降壓藥在血漿基質(zhì)中進行分離，獲得的色譜圖如圖2。

圖2 血漿基質(zhì)中HCT、ATN和RSP分離色譜圖

對比圖1和圖2看出，血漿基質(zhì)對三種降壓藥的分離并不存在干擾。

2.3 尿液基質(zhì)中的分離

在最佳的分離條件下，將HCT、ATN和RSP三種降壓藥在尿液基質(zhì)中進行分離，獲得的色譜圖3。

圖3 尿液基質(zhì)中HCT、ATN和RSP分離色譜圖

對比圖1和圖3看出，尿液基質(zhì)對三種降壓藥的分離并不存在干擾。

3 結(jié)論