重組抗HER2人源化單克隆抗體大規(guī)模制備及活性鑒定方法學(xué)建立

陳觀平，汪一帆，應(yīng)栩華

(浙江省立同德醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤研究所，浙江 杭州 310012)

我國(guó)每年乳腺癌新發(fā)病24.9萬(wàn)，居女性惡性腫瘤第1位，病死率居第5位，且其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害了廣大婦女的健康。研究顯示，25%-30%的乳腺癌患者存在HER2(人表皮生長(zhǎng)因子受體-2)蛋白的過(guò)量表達(dá)[1]。HER2表達(dá)量越高，腫瘤的惡性程度也越高，患者預(yù)后越差[2]。

HER2靶向治療的推出大大提高了HER2+乳腺癌患者的長(zhǎng)期存活率，并為各個(gè)階段都提供了多種治療選擇。其中被臨床應(yīng)用并證明有效的抗體是人表皮生長(zhǎng)因子受體2抗體(Anti-her2)[3]。單抗Anti-her2可與HER2受體胞外區(qū)特異性結(jié)合，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，并使過(guò)量表達(dá)HER2受體的腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒性因子更加敏感[4]。HER2單抗的出現(xiàn)，很大程度上改善了HER2陽(yáng)性乳腺癌患者的治療及預(yù)后。

重組單抗具有高特異性、高活性和低毒性等特點(diǎn)，從而使其在醫(yī)藥領(lǐng)域備受關(guān)注，并逐漸成為國(guó)內(nèi)外藥物研發(fā)企業(yè)的研究熱點(diǎn)。目前，重組抗體的生產(chǎn)主要依賴(lài)哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。該表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于可進(jìn)行包括糖基化修飾在內(nèi)的各種翻譯后修飾，從而使獲得的重組蛋白具有與人體來(lái)源相似的糖蛋白結(jié)構(gòu)[5]。本實(shí)驗(yàn)中，我們利用構(gòu)建的HER2人源化單克隆抗體重鏈及輕鏈表達(dá)載體轉(zhuǎn)化中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)，篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)重組HER2人源化單克隆抗體的細(xì)胞株，并小規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)重組抗體，為后續(xù)深入研究HER2過(guò)表達(dá)與乳腺癌的關(guān)系及其基因治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒及細(xì)胞Anti-her2重鏈、輕鏈模板：pMC-her2 HC、pMC-her2 LC由西湖大學(xué)金煒元副研究員饋贈(zèng)；中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系CHO(CHO-K1細(xì)胞系經(jīng)過(guò)懸浮馴化)為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器Protein A柱、Q-Sepharose離子交換柱(美國(guó)GE公司)；電轉(zhuǎn)化儀(美國(guó)Bio-rad MicroPulser)；CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo HERAcell 150i)，高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent 1200)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone，批號(hào)：AE24921272)，胎牛血清(Gibco，批號(hào)：42F3495K)，G418(Gibco，批號(hào)：1833291)，CD CHO(Gibco，批號(hào)：2202258)， FC抗體(CST，批號(hào)：12)，其他實(shí)驗(yàn)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 重組抗HER2人源化單克隆抗體制備方法學(xué)的建立

1.4.1細(xì)胞電擊轉(zhuǎn)化 CHO細(xì)胞接種于T75培養(yǎng)瓶中，加入DMEM/F12+10% FBS，37 ℃，5% CO2下貼壁培養(yǎng)。待細(xì)胞貼滿(mǎn)80%底面積后，胰酶消化，取細(xì)胞約5×106cells重懸于200 μL PBS中，并加入30 μg載體DNA(pMC-her2 LC：20 μg，pMC-her2 HC：10 μg)及10 μg鮭魚(yú)精DNA混勻(保護(hù)目標(biāo)DNA)，950 μF、250 V電擊轉(zhuǎn)化2次，冰浴1 min后鋪于100 mm培養(yǎng)皿，加入DMEM/F12+20% FBS，37 ℃，5% CO2下貼壁培養(yǎng)。

1.4.2克隆篩選 約1～2 d待細(xì)胞貼壁伸展，抗性基因充分表達(dá)后，加入含1.5 g·L-1G418的DMEM/F12+10% FBS進(jìn)行抗性篩選。約3-4 d后，用PBS輕輕淋洗去除死細(xì)胞，降低G418濃度至600 mg·L-1維持2-3 d，單克隆形成。盡量選取單獨(dú)的克隆轉(zhuǎn)移至96孔板，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)5-7 d。

1.4.3克隆表達(dá) 待細(xì)胞在96孔板中匯合度達(dá)到80%左右，換液成無(wú)血清的DMEM/F12，37 ℃，5% CO2下表達(dá)1 d，取樣進(jìn)行Dot blot檢測(cè)。

1.4.4免疫斑點(diǎn)雜交檢測(cè) 取5 μL上清樣品點(diǎn)于硝酸纖維膜(NC膜)，室溫干燥，加入5%牛奶/TBST封閉30 min，棄溶液，加入1%牛奶稀釋的抗FC(1 ∶15 000)抗體，37 ℃ 30 min后棄去溶液，用TBST 漂洗3次，每次10 min。底物曝光(ECL Western blot detection reagents)[6]。

1.4.5克隆放大培養(yǎng) 挑選Dot blot檢測(cè)表達(dá)量最高的5個(gè)克隆株進(jìn)行再次克隆操作，挑選穩(wěn)定表達(dá)的其中1個(gè)二次克隆株，加入DMEM/F12+10% FBS，37 ℃，5% CO2傳代擴(kuò)種，擴(kuò)到3個(gè)T75培養(yǎng)瓶后胰酶消化，用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)搖瓶懸浮擴(kuò)增，接種密度2×109cells·L-1，體積30 mL。培養(yǎng)基采用CD CHO。待細(xì)胞密度擴(kuò)增至6×109cells·L-1左右，接種至1 L搖瓶培養(yǎng)，接種密度2×109cells·L-1。d2開(kāi)始取樣，并每天添加5 mL CD CHO及1.5 g·L-1葡萄糖，最終樣品收液純化。

1.4.6蛋白純化 細(xì)胞培養(yǎng)液離心后去沉淀，上清液經(jīng)0.8 μm和0.45 μm濾膜過(guò)濾后，以20 mL·min-1的流速上樣于 Protein A柱，10 mmol·L-1檸檬酸，0.2 mol·L-1NaCl緩沖液洗脫；再經(jīng) Q-Sepharose離子交換柱分離，上樣緩沖液為10 mmol·L-1PB，0.2 mol·L-1NaCl，隨后用 Sephacryal-200 凝 膠 層 析 柱 純 化，10 mmol·L-1PB，0.15 mol·L-1NaCl洗脫,洗脫液HPLC分析。

1.4.7還原型及非還原型SDS-PAGE檢測(cè) 取表達(dá)后的純化蛋白5 μL，分別進(jìn)行還原型及非還原型SDS-PAGE檢測(cè)，其中，還原型電泳上樣緩沖液含β-巰基乙醇，非還原型電泳上樣緩沖液不含β-巰基乙醇，加入等體積上樣緩沖液后沸水浴10 min，12 000 r·min-1離心5 min后取上清電泳，至溴酚藍(lán)的帶近底端1 cm 時(shí)，停止電泳。考馬斯亮藍(lán)染色3 h。脫色液脫色至能清晰顯示出蛋白條帶止[7]。

1.4.8Western blot檢測(cè) 應(yīng)用Western blot檢測(cè)表達(dá)蛋白的特異性：樣品經(jīng)SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%的脫脂奶粉封閉60 min，棄溶液，加入一抗，37 ℃ 30 min后棄去溶液，用TBST漂洗3次，每次5 min。然后加入二抗，室溫孵育1.5 h，再次TBST洗膜4次，底物曝光[8]。

1.5 重組抗HER2人源化單克隆抗體體外活性檢測(cè)

1.5.1體外生物學(xué)活性測(cè)定 完全培養(yǎng)基(M-Hybricare)培養(yǎng)BT474細(xì)胞，將細(xì)胞稀釋至0.25×104cells/well后在96孔板上按每孔100 μL接種細(xì)胞。將重組抗HER2人源化單克隆抗體和市售品“赫賽汀”分別稀釋到1 mg·L-1初始濃度，倍比稀釋不同梯度后為試驗(yàn)組，不加藥為對(duì)照組。孵育48 h，每孔加入100 μL CCK-8和RPMI 1640混合培養(yǎng)基(1 ∶10，V/V)，37℃孵育1 h，450 nm讀數(shù)。利用GraphPad 7.0計(jì)算Anti-her2的IC50，了解其體外生物學(xué)活性。

1.5.2Anti-her2對(duì)細(xì)胞的增殖抑制檢測(cè) 采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度Anti-her2及“赫賽汀”對(duì)BT474細(xì)胞增殖抑制的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BT474細(xì)胞懸液，96孔板每孔接種5 000個(gè)細(xì)胞，并加100 μL的RPMI 1640培養(yǎng)基，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，按照空白組(單純培養(yǎng)液)、對(duì)照組(細(xì)胞懸液+DMSO)和試驗(yàn)組(Anti-her2及“赫賽汀” 濃度梯度分別為0、0.004、0.008、0.016、0.03 mg·L-1、0.06、0.125、0.25、0.5)加入各試劑。48 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定各孔的吸光值。細(xì)胞存活率/% =[( OD試驗(yàn)孔-OD空白孔)/( OD對(duì)照孔-OD空白孔)]×100%。

2 結(jié)果

2.1 重組抗HER2人源化單克隆抗體的制備

2.1.1克隆篩選檢測(cè) 電擊轉(zhuǎn)化后共鋪2個(gè)100 mm 培養(yǎng)皿，經(jīng)G418篩選后，挑取2塊96孔板。表達(dá)后Dot blot檢測(cè)表明，最高表達(dá)克隆表達(dá)量在30 mg·L-1左右。其余均在2.5-10 mg·L-1，見(jiàn)Fig 1。

Fig 1 Dot blot of recombinant humanized Anti-her2 monoclonal antibody

2.1.2克隆放大檢測(cè) 取Dot blot檢測(cè)表達(dá)量最高的一次克隆進(jìn)行二次克隆，表達(dá)穩(wěn)定的二次克隆進(jìn)行放大培養(yǎng)，種子擴(kuò)增后接種至1 L搖瓶流加培養(yǎng)，共培養(yǎng)13 d，細(xì)胞活率從d 11起下降。培養(yǎng)最高細(xì)胞密度為8.1×109cells·L-1，最高表達(dá)量145.3 mg·L-1。最終收液1.2 L，蛋白BCA定量結(jié)果135.9 mg·L-1,見(jiàn)Fig 2。

Fig 2 Small scaling-up of recombinant humanized Anti-her2 monoclonal antibody

2.1.3HER2人源化單克隆抗體的純度檢測(cè) 蛋白原液經(jīng)Protein A 親和純化，對(duì)純化后的Anti-her2進(jìn)行HPLC 檢測(cè)，結(jié)果表明，目的蛋白純度大于99%，見(jiàn)Fig 3。非還原SDS-PAGE 檢測(cè)顯示在185 kD附近出現(xiàn)了與目標(biāo)蛋白理論大小相同的條帶，樣品中含有完整的抗體分子，見(jiàn)Fig 4A。還原的純化樣品中分別含有抗體的輕重鏈，輕重鏈結(jié)構(gòu)完整，大小與理論值一致,見(jiàn)Fig 4B。

Fig 3 HPLC analysis of purified recombinant humanized Anti-her2 monoclonal antibody

Fig 4 SDS-PAGE analysis of purified recombinant humanized Anti-her2 monoclonal antibody

2.1.4HER2人源化單克隆抗體的Western blot免疫分析 純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)膜并Western blot免疫分析，還原與非還原電泳后轉(zhuǎn)膜均與FC單克隆抗體發(fā)生了特異性免疫反應(yīng)，非還原電泳膜上出現(xiàn)與目標(biāo)蛋白理論大小相同的條帶，并帶有部分小片段非主帶，這與SDS-PAGE結(jié)果吻合，說(shuō)明純化蛋白可能存在部分重輕鏈裝配不完全，見(jiàn)Fig 5A，還原電泳膜上出現(xiàn)兩條干凈的重鏈、輕鏈，且濃度比例基本為1 ∶2，結(jié)合SDS-PAGE結(jié)果，說(shuō)明表達(dá)產(chǎn)物是重組HER2人源化單克隆抗體，且重氫鏈裝配基本準(zhǔn)確，見(jiàn)Fig 5B。

Fig 5 Western blotting of purified recombinant humanized Anti-her2 monoclonal antibody

2.2 重組抗HER2人源化單克隆抗體體外生物學(xué)活性分析

2.2.1體外生物學(xué)活性檢測(cè) 利用赫塞汀標(biāo)準(zhǔn)品配制的9個(gè)稀釋度(0、0.006、0.012、0.023、0.047、0.188、0.375、0.75、1 mg·L-1)，測(cè)定擬合優(yōu)度，相關(guān)系數(shù)r>0.95，符合檢測(cè)要求，檢測(cè)范圍為0.031-0.375 mg·L-1，見(jiàn)Fig 6。體外活性檢測(cè)結(jié)果表明，表達(dá)抗體能夠有效的對(duì)BT-474細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制活性，其抑制率基本與赫塞汀相近，見(jiàn)Fig 7，經(jīng)GraphPad Prism7.0計(jì)算得其IC50值為0.103，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了兩者在生物學(xué)活性方面的相似性。

Fig 6 Goodness-of-fit testing of Anti-her2

Fig 7 Comparison of bioactivity of Anti-her2 and Herceptin on

2.2.2Anti-her2對(duì)BT-474細(xì)胞的增殖抑制檢測(cè) 體外增殖實(shí)驗(yàn)表明，Anti-her2和“赫賽汀”對(duì)BT-474細(xì)胞的增殖抑制呈劑量依賴(lài)關(guān)系，在低濃度區(qū)間0.06-0.2 mg·L-1，就表現(xiàn)出極高的抑制效率，隨著劑量的增加，抑制效果并無(wú)低濃度區(qū)間增加明顯，見(jiàn)Fig 8，在藥物濃度達(dá)到1.0 mg·L-1時(shí)，兩者對(duì)BT-474細(xì)胞的抑制達(dá)到最大值。

Fig 8 Comparison of inhibitory effect of Anti-her2 and Herceptin on

2.2.3Anti-her2對(duì)BT-474 HER2蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，與未加抗體對(duì)照組相比，“赫賽汀”與Anti-her2處理組HER2蛋白的表達(dá)均有所降低，這提示“赫賽汀”與Anti-her2均可明顯抑制BT-474中HER2蛋白的表達(dá)。見(jiàn)Fig 9。

Fig 9 Comparison of HER2 expression of Anti-her2 and Herceptin on BT-474

3 討論

HER2 蛋白的過(guò)量表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān),其中以乳腺癌最為密切[9]。研究顯示，HER2蛋白的過(guò)量表達(dá)往往能破壞機(jī)體組織的抗侵襲屏障，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的侵襲力增加。HER2蛋白能顯著增加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤新生血管形成，并促進(jìn)癌細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。這些特殊的生物功能揭示HER2可作為乳腺癌生物治療的靶點(diǎn)[10]。

HER2 人源化單克隆抗體是一個(gè)針對(duì)HER2蛋白過(guò)量表達(dá)的人源單抗，其在臨床試驗(yàn)和后續(xù)應(yīng)用中均取得了確切療效[11]。在疾病治療中，人源化單抗能有效降低機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)，同時(shí)其Fc段能募集效應(yīng)因子或效應(yīng)細(xì)胞,對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生殺傷。人源化抗體中Fc 段也可特異地結(jié)合人血管內(nèi)皮細(xì)胞上的Fc受體而不被很快降解，從而延長(zhǎng)其在體內(nèi)的半衰期。但不同方法制備單抗的抗腫瘤活性可能有非常顯著的差異，研究HER2 人源化單抗生產(chǎn)工藝，并建立穩(wěn)定的重組蛋白表達(dá)體系，對(duì)于人源化抗體技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用具有非常重要的意義[12]。

我們利用Anti-her2重鏈、輕鏈真核表達(dá)載體質(zhì)粒，共同轉(zhuǎn)化中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞，經(jīng)二次克隆及G418篩選、免疫組化鑒定,獲得了能夠穩(wěn)定表達(dá)HER2 人源化單克隆抗體的CHO 細(xì)胞株。同時(shí)采用搖瓶懸浮流加培養(yǎng)，進(jìn)行小規(guī)模放大生產(chǎn)重組目的蛋白，搖瓶懸浮流加可通過(guò)更為精確有效的工藝控制，在獲得表達(dá)蛋白高產(chǎn)的同時(shí)穩(wěn)步提高產(chǎn)品質(zhì)量。本次流加培養(yǎng)的表達(dá)量達(dá)到135.9 mg·L-1，經(jīng)純化后檢測(cè)分析，其在純度及生物學(xué)活性方面、對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制方面，基本與商業(yè)化“赫賽汀”標(biāo)準(zhǔn)品保持一致。

穩(wěn)定高效表達(dá)重組蛋白主要依靠克隆的篩選及后期培養(yǎng)工藝參數(shù)的優(yōu)化，本研究建立了HER2 人源化單克隆抗體的規(guī)模化穩(wěn)定表達(dá)方法，為進(jìn)一步大規(guī)模培養(yǎng)放大和工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。