微透析結合代謝組學探究佐劑性關節炎大鼠的代謝擾動及牛膝總皂苷的干預作用

張 衡，吳 虹,卜妍紅，孫明慧，鄧 然，王 言，王夢蝶，王榮慧，吳 歡

(1. 安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2. 新安醫學教育部重點實驗室，中藥研究與開發安徽省重點實驗室，中藥復方安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012)

類風濕關節炎 (rheumatoid arthritis，RA) 是一種慢性、系統性自身免疫疾病，病理特征為慢性滑膜炎性增生、侵蝕性血管翳形成及關節軟骨退化等[1]。中藥牛膝為莧科植物牛膝 (achyranthes bidentata BI) 的干燥根[2]，主要含有皂苷、植物甾酮以及糖類等成分，其主要有效成分牛膝總皂苷 (achyranthes bidentate saponins, ABS) 為五環三萜類化合物，具有抗炎鎮痛，抗腫瘤以及調節免疫等作用[3]，對類風濕關節炎，骨關節炎和骨質疏松等疾病具有良好的治療作用[4]。

微透析技術 (microdialysis，MD) 是一種實時在體微量取樣技術，能針對靶部位細胞外液中的化合物 (包括內源性、外源性) 進行連續在體的取樣。MD技術采集到的樣品由于通過透析膜，生物大分子無法通過，可直接用于分析檢測而無需預處理[5]。本研究將MD探針植入AA大鼠關節腔采樣，結合UPLC-Q-TOF/MS技術尋找并鑒定與RA相關的生物標志物，解析可能的代謝途徑，從代謝組學角度闡明ABS干預RA的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康的SD大鼠,♂，體質量(180-220) g，SPF級，許可證號SCXK (魯) 20190003，購于安徽中醫藥大學實驗動物中心，在恒溫 (24 ℃)、自然光暗周期和自由飲水條件下飼養1周，待其適應環境后進行實驗。

1.2 藥材與試劑牛膝藥材購自同仁堂，由安徽中醫藥大學藥學院生藥教研室劉守金教授鑒定為懷牛膝；弗氏完全佐劑(FCA) (F5881)；乙醇(TEDIA公司，色譜純)；甲酸(阿拉丁公司，色譜純)；乙腈(批號：106246，美國Fisher公司，色譜純)。

1.3 儀器KQ-200KDB 型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司) ；SYZ-C石英第二沸騰高純水蒸餾器 (杰瑞爾電氣有限公司，中國) ；微透析灌注泵 CMA400 (瑞典CMA公司) ；微透析灌注器Ms-gan250、微透析收集器CMA470 (瑞典CMA公司) ；微透析探針 (MAB 6.14.4.C，膜長10 mm，直徑0.6 mm, 截留分子量15 kDa) ；YLS-7C型足趾容積測量儀 (北京凱輝盛達科技發展有限公司) ；Waters Acquity UPLC超高效液相色譜系統 (Waters Corporation，美國) ；Waters QTOF 高分辨率飛行時間質譜儀 (Waters Corporation，美國) ；ME204電子天平 (瑞士METTLE TOLEDO公司)。

1.4 SD大鼠分組隨機把SD大鼠分成空白對照組、ABS組 (60 mg·kg-1) 及AA模型組，每組6只，除對照組外，大鼠右后足均用FCA (0.1 mL) 注射，建立AA大鼠模型，對照組注射同體積生理鹽水，造模成功d 1 (致炎d 17)后ABS組連續灌胃給藥7 d，每日1次，模型組及對照組用同體積的生理鹽水灌胃。

1.5 ABS的提取與定量測定懷牛膝樣品粉碎成均勻粉末，稱取100 g，放入圓底燒瓶 (2 L) 加入1 L乙醇加熱回流提取3次，1 h/次，合并提取液，70 ℃水浴旋蒸濃縮至無醇味，剩余提取液加入純水定容至1 L，超聲10 min，抽濾后量取150 mL過D101型大孔吸附樹脂柱，先用600 mL純水洗脫水溶性成分，棄去；然后用500 mL 70 %乙醇洗脫，洗脫液收集干燥至恒重[7]。采用紫外可見分光光度法測定提取后ABS的含量達55.34%。

1.6 UPLC-Q-TOF/MS檢測AA大鼠關節腔微透析液

1.6.1制備林格氏液 林格氏液由8.6 g的NaCl，0.28 g的CaCl2和0.3 g的KCL溶于1 000 mL超純水，使用前過0.22 μm的微孔濾膜。

1.6.2樣品的處理及QC樣品的制備 微透析探針植入大鼠膝關節腔，實時檢測大鼠的體溫使其維持在37 ℃。收集每只大鼠的720 μL微透析液樣品 (灌流速度1.5 μL·min-1, 收集周期為8 h) 并貯藏于-80 ℃。在分析之前，將透析液樣品通過真空離心器干燥。然后用甲醇重新復溶，渦旋，并在4 ℃，14 000 r·min-1離心10 min。所有微透析樣品各取10 μL，用作QC樣品。

1.7 組織病理學檢查將大鼠麻醉，腹腔取血。取大鼠膝關節滑膜，用10% (v / v) 多聚甲醛固定，經脫鈣、脫水、石蠟包埋切片后，用蘇木精-伊紅 (HE) 染色法染色，顯微鏡下觀察滑膜組織病理形態變化。

1.8 關節腫脹度、關節炎評分測定實驗前使用足趾容積測量儀測定各組大鼠的足趾腫脹度，AA大鼠在造模后d 7開始，對各組大鼠進行足趾容積測定 (3 d/次),腫脹度：△=造模后足趾容積平均值-造模前足趾容積平均值。采用關節炎指數 (arthritic index，AI) 評分法對各組大鼠評分 (3 d/次)。

1.9 液質聯用條件UPLC色譜條件 色譜柱：HILIC column (waters公司, 2.1 mm×100 mm, 1.7 μm); 柱溫35 ℃；樣品室溫度保持6 ℃ 流速 200 μL·min-1；流動相為乙腈(A)-0. 1%甲酸水溶液 (B)，梯度洗脫 (0-3 min，95% A; 3-8 min，90%-82% A; 8-12 min，82%-65% A; 12-15 min，65%-90%A；15-18 min, 95%A )。

質譜條件電噴霧離子源 (ESI) 在正、負離子模式分別進行MSE掃描；低碰撞電壓：6 V；高碰撞電壓：20-30 V；離子源溫度：120 ℃；錐孔電壓：40 V；電噴霧電壓：2.5 kV；干燥氣溫度：350 ℃；掃描范圍：50-1 200 m/z。

1.10 代謝組學數據處理

1.10.1多元統計分析 依次將UPLC-Q-TOF/MS在ESI+和ESI-模式下采集的各組質譜數據導入Progenesis QI v3.03軟件用于自動數據處理 (包括峰值拾取、保留時間 (tR) 校正和歸一化)。通過QI軟件的閾值 (P<0.05, fold changes ≥ 1.5, CV<30%) 進一步篩選數據。然后將篩選數據集導入Ezinfo 3.0軟件中進行多元統計分析，包括無監督的主成分分析 (PCA) 及有監督的正交偏最小二乘法判別分析 (OPLS-DA)。根據VIP >1.0來選出差異離子。

1.10.2潛在生物標志物的識別和代謝通路分析 將篩選過的差異代謝物的m/z和質譜高能量下的離子碎片信息與Human Metabolome Database (HMDB) (https://hmdb.ca/) 以及查閱文獻自建的數據庫進行匹配來確認篩選后的潛在代謝物。使用網絡分析平臺MetaboAnalyst 4. 0 (https://www.metaboanalyst.ca) 對ABS干預RA相關的潛在生物標志物進行代謝通路富集分析及拓撲分析。

2 結果

2.1 各組大鼠足腫脹度與關節炎評分各組大鼠的關節炎評分及左后肢的繼發性足腫脹見Fig 1 (A、B)。與AA組相比，ABS組在給藥d 6 (造模d 23后) 對AA大鼠的足腫脹具有抑制作用并能改善其關節炎評分 (P<0.05)。這些結果表明AA大鼠模型構建成功，ABS能明顯改善RA癥狀。

Fig 1 Secondary paw swelling, arthritis score and pathological changes of synovial tissues in each group of rats

2.2 各組大鼠滑膜組織病理形態學變化HE染色結果如Fig 1 (C、D、E) 所示：對照組大鼠關節滑膜組織的細胞表面排列均勻、整齊，未出現滑膜異常增生(Fig 1C)；AA組大鼠滑膜組織明顯觀察到滑膜間質有大量炎性細胞浸潤，滑膜細胞增殖、呈錯亂排列 (Fig 1D) ；ABS組 (60 mg·kg-1) 滑膜細胞排列尚整齊，但有少量炎性細胞浸潤 (Fig 1E)。

2.3 關節腔微透析液中代謝物的分離采用UPLC-Q-TOF/MSE在正、負離子模式下采集AA組、ABS組、對照組微透析樣品的LC-MS數據，總離子色譜圖 (Fig 2)。生成的原始UPLC-Q-TOF/MS數據集經Progenesis QI v3.03軟件導入Ezinfo 3.0進行無監督的PCA以及有監督的OPLS-DA分析。PCA圖 (Fig 3) 表明對照組、AA組、ABS組代謝輪廓具有明顯差異。ABS組的數據矩陣有從模型組到對照組的回歸趨勢，表明ABS給藥組對AA大鼠的代謝紊亂有糾正作用。

Fig 2 Representative TICs of microdialysis sample

Fig 3 PCA score plots of QCP samples and all tested samples of Control，AA，ABS groups in ESI+ mode (A) and ESI- mode (B)

2.4 潛在生物標志物的篩選和鑒定OPLS-DA分析結果顯示：在正、負離子模式下，對照組和AA組以及AA組和ABS給藥組均可以被明顯地區分(Fig 4)。S-plots (Fig 4)中，距離中心區域越遠代表代謝物在兩組之間分離度越大。其中紅框中的代謝物為VIP>1.0，這些化合物為潛在的生物標志物。OPLS-DA及S-plots篩選出的差異代謝物，在正、負離子模式下共獲得了19種與ABS干預AA相關的生物標志物，見Tab 1。由潛在的生物標志物生成的heatmap呈現了3組之間的差異，見Fig 5。其中，與AA組相比，上述19種生物標志物在ABS干預后能在不同程度上接近對照組水平。例如，在AA組中Asparaginylarginine，15-Deacetylcalonectrin，AMP，Palmitoleoyl Ethanolamide，Pentadecanoylcarnitine，Sebacic acid，Stearic acid，GMP，Uridine 5′-monophos-phate，Palmitic acid， 3,5-Dichloro-4-hydroxy-2-methoxy-6-methylbenzoic acid和Cortisol等生物標志物水平明顯增加，但ABS組與之相比呈下降趨勢。同樣地，AA組中Cytidine，PA(18:0/14:1(9Z))，xi-3-(4-Isopropylphenyl)-2-methylpropanal，Prenyl glucoside，Diisobutyl phthalate，Kinetensin 1-3和Arnamiol等標志物水平明顯降低，但ABS組與之相比呈增加趨勢。

Fig 4 OPLS-DA score plot and S-plot plot of rat microdialysis samples

Fig 5 Heat map of metabolite levels in control,AA and ABS groups

Tab 1 Potential biomarkers identified by UPLC-QTOF/MS

2.5 代謝通路分析為了識別受ABS影響的可能代謝途徑，通過MetaboAnalyst 4.0軟件構建代謝途徑分析發現，ABS治療RA的代謝途徑主要涉及嘌呤、嘧啶、脂肪酸等代謝，見Fig 6。

Fig 6 Pathway enrichment analysis of 19 potential biomarkers responsible in treatment of ABS

3 討論

中藥牛膝具有活血化瘀、滋補肝腎及引藥下行等功效。本課題組前期研究了牛膝不同極性提取部位的抗炎、鎮痛效果，結果顯示，正丁醇萃取的三萜皂苷類化合物能顯著減輕小鼠耳腫脹度，降低胸腺指數及脾指數，提示其能抑制體內的免疫反應并具有顯著的抗炎鎮痛作用[6]。已有研究證明，ABS對RA具有療效，但其干預機制尚不明確，需要進一步探究[7]。

在關節腔微環境中，內源性代謝物與基質可能存在特異性或非特異性結合。傳統的樣本處理方法通過加入試劑解除其相互作用。適宜規格的微透析探針能阻斷大分子物質穿過而選擇性采集小分子代謝物，其“采樣”與“純化”的雙重功能，可得到無生物大分子的微透析樣品，相比于血樣和組織樣品純凈度高，無需樣品前處理可直接進樣分析，避免了前處理的冗長及可能帶來的誤差，使代謝組學結果更加客觀[8]。

本研究表明，ABS給藥能有效抑制AA大鼠的繼發性腫脹，且明顯改善滑膜增生和炎性細胞浸潤。建立基于UPLC-Q-TOF/MS結合微透析技術的代謝組學方法，從內源性差異代謝物的角度來探究ABS抗RA的機制。代謝組學的PCA圖表明，ABS組有向對照組水平回歸的趨勢，故ABS具有改善RA病理過程代謝紊亂的作用，并鑒定出19個與ABS干預RA有關的生物標志物。這些生物標志物主要涉及嘌呤代謝、脂肪酸代謝、嘧啶代謝和類固醇激素代謝等途徑。結合關節炎評分、足腫脹度及滑膜組織病理形態學變化等指標的變化，發現ABS組比AA模型組更接近對照組，表明ABS主要通過調節嘌呤、嘧啶、脂肪酸和類固醇激素的代謝紊亂以及抑制炎癥和調節免疫來緩解RA的進程。

3.1 嘌呤代謝的變化越來越多的研究結果表明RA的發展與嘌呤代謝紊亂有關。嘌呤代謝參與多種生理和病理過程，通過參與炎癥反應，在RA的病理過程中發揮作用[9-11]。在炎癥部位中，各種細胞(如免疫細胞)分泌一系列細胞間效應分子，將三磷酸腺苷(ATP)釋放到胞外，ATP和二磷酸腺苷(ADP)通過胞外二磷酸三磷酸核苷水解酶1 (CD39)轉化為一磷酸腺苷(AMP)，從而導致AMP水平上升[12]。CD39和胞外ATP在FOXP3+調節性T細胞的免疫抑制功能中也起著重要作用。CD39在FOXP3+調節性T細胞中表達并促進腺苷的產生，腺苷的產生會使FOXP3+調節性T細胞分泌免疫抑制細胞因子如IL-10。此外，研究表明腺苷的產生會使細胞內AMP水平增加。在本實驗中，AA大鼠的嘌呤代謝出現了明顯的變化，其中，AMP水平明顯升高，ABS給藥后恢復到正常水平。表明ABS干預后的AA大鼠嘌呤代謝紊亂得到逆轉，ABS可能通過干預嘌呤代謝途徑發揮治療RA作用。

3.2 脂肪酸代謝的變化脂肪酸，包括飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，參與多種疾病代謝過程，如RA、II型糖尿病和心血管疾病的發展[13]。研究表明，在RA中炎性細胞因子TNF-α刺激脂肪組織分解釋放游離脂肪酸，導致血漿中游離脂肪酸水平升高[14]。也有研究表明，硬脂酸和棕櫚酸在RA中均具有顯著變化，是預測RA的重要生物標志物[15-16]。本研究結果表明，AA大鼠的硬脂酸和棕櫚酸水平顯著增高，并在ABS的干預下回調至正常水平，提示ABS可能通過降低游離脂肪酸水平，改善脂肪酸生物合成途徑的代謝紊亂而達到干預RA的作用。

3.3 嘧啶代謝的變化本研究發現，與對照組相比，模型組中的胞苷水平下降，一磷酸尿嘧啶水平升高。在ABS給藥后，胞苷和一磷酸尿嘧啶的水平均恢復到接近對照組的水平，結果表明ABS具有改善嘧啶代謝紊亂的作用。嘧啶核苷酸衍生物也能對細胞信號和能量代謝起到調節作用。然而，與嘌呤核苷酸衍生物在細胞生物功能中的作用相比，嘧啶核苷酸衍生物的相關報道較少，推測ABS可能通過調節嘧啶代謝紊亂干預RA。

3.4 類固醇激素的變化皮質醇是類固醇激素的一種，在離子運輸、心血管系統、免疫功能和中樞神經系統等方面具有調節作用[17]。研究表明，RA炎性條件下，炎性細胞因子TNF-α和IL-1β激活肝臟中11b-羥基類固醇脫氫酶 (11b-HSD) 使血清中皮質醇水平升高[18]。實驗結果發現相比于對照組，模型組皮質醇水平升高，ABS下調過高的皮質醇水平，表明ABS可能通過調節類固醇激素代謝發揮治療RA的作用。

本研究將微透析技術與UPLC-Q-TOF/MS相結合，檢測AA大鼠關節腔微透析液中代謝物的變化。經多元統計分析，共篩選出19個與牛膝總皂苷干預AA相關的潛在生物標志物，通過通路富集分析發現它們主要涉及嘌呤代謝、嘧啶代謝、脂肪酸合成及類固醇激素合成途徑。研究表明微透析結合代謝組學研究能揭示ABS干預AA的代謝相關機制，為ABS作用機制的深入探討奠定。