氟西汀對PC12細胞缺氧損傷的保護作用

曹琪璐，劉 菁，趙 彤，陳克明，馬慧萍，賈正平

(1.蘭州大學藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院，甘肅 蘭州 730050)

氟西汀是目前臨床常用的抗抑郁藥，其作用機制是作為選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑來抑制神經元對5-羥色胺的再攝取。最近有學者報道，氟西汀還具有神經保護作用，Zhao等[1]發現氟西汀處理的抑郁癥大鼠神經元凋亡減少，凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3水平下調；Zeng等[2]報道氟西汀通過PI3K/Akt/Fox03a和PKA/CREB信號通路對抗皮質酮所致的PC12細胞損傷發揮保護作用；Hu等[3]發現氟西汀可改善腦缺血小鼠的記憶障礙，其可能機制是氟西汀可以促進細胞實驗中海馬神經干細胞的存活，增加海馬回和齒狀回區神經細胞增殖，抑制細胞凋亡。

課題組在前期抗高原缺氧損傷研究中發現，由模擬高原環境引起的大鼠高原腦水腫模型中腦組織5-羥色胺轉運蛋白(serotonin transporter, SERT)蛋白和基因表達量均顯著上升，預先服用抗高原缺氧損傷藥物后，不但高原腦水腫發病情況明顯減輕，而且SERT的表達量也顯著下降。用體外培養PC12細胞可以模擬這一過程。我們為此提出假說：SERT高表達也許是缺氧環境引起高原腦水腫的重要原因，抑制其高表達可能預防高原腦水腫。由于氟西汀是SERT抑制劑，故我們推測應用氟西汀有可能獲得抗缺氧損傷效果。本實驗首先考察了氟西汀對PC12細胞缺氧損傷的保護作用，得到了理想的結果，初步證明本假說的科學性， 現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要儀器 CO2細胞培養箱(Thermo公司，美國)；缺氧處理小室(STEMCELL，加拿大)；氧濃度檢測儀(EST-10，CSE，美國)；熒光倒置相差顯微鏡(IX3-SVR，Olympus，日本)；免疫印跡分析儀(1703930，Bio-Rad，美國)；高分辨活細胞成像系統(Delta Vision Ultra，Cytiva，美國)。

1.1.2細胞株 PC12細胞(ATCC CRL-1721.1TM)，購自美國模式培養物集存庫(American type culture collection,ATCC)。

1.1.3藥物與試劑 鹽酸氟西汀(Y110140，MCE，美國)；F-12K培養基 (21127022，Gibco，美國)；馬血清(04-004-1，ABI，以色列)；胎牛血清(10099-141，Gibco，美國)；CCK-8(BA00208，博奧森生物，中國)；乳酸脫氫酶(A020-2-2，LDH)、丙二醛(A003-4-1，MDA)、超氧化物歧化酶(A001-3-2，SOD)和過氧化氫酶(A007-1-1，CAT)試劑盒購于南京建成生物；MAP2 (ab32454)、Bax (ab170114)、Bcl-2 (ab196495) 和caspase-3(ab13847)抗體購自英國Abcam公司；RIPA 裂解液(R0020)、4×緩沖液(P1015)、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒(P1200)、ECL等購于北京索萊寶公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養 取對數生長期的PC12細胞，0.25%的胰酶消化，用含15%馬血清、2.5%胎牛血清的F-12K培養基培養，每隔2-3 d更換一次培養液。

1.2.2免疫熒光染色 將細胞傳代接種于鋪有細胞爬片的6孔板中，待細胞貼壁并長滿80%皿底后進行缺氧及加藥處理，之后棄掉培養液，用PBS洗片，加入預冷的4%多聚甲醛固定10 min，洗片，加入0.1% Triton X-100透膜10 min，洗片，加入免疫熒光封閉液封閉1 h，棄封閉液，不洗，直接加入MAP2一抗，4 ℃冰箱過夜，次日洗片后，加入二抗，4 ℃冰箱避光孵育過夜，d3早晨從冰箱取出，洗掉二抗后，DAPI 孵育15 min，避光封片，放置陰暗環境下晾干，用活細胞工作站觀察染色情況。

1.2.3缺氧損傷模型的建立 待培養于中皿的PC12細胞長至接近融合后，將其轉入缺氧盒中，通入94% N2、1% O2和5% CO2的混合氣，氧濃度降至1%后開始計時，18 h后觀察細胞形態并進行各項指標的檢測。

1.2.4藥物處理 準確稱取鹽酸氟西汀3.457 9 mg，融入100 μL DMSO后得到濃度為0.1 mol· L-1的鹽酸氟西汀母液，逐級稀釋，吸10 μL上級濃度，加入到90 μL的DMSO中，得到濃度分別為10-2、10-3、10-4和10-5mol·L-1溶液，放入-20 ℃保存待用。用培養基稀釋時，需現配現用。

1.2.5細胞活力檢測 采用CCK-8試劑盒。將對數生長期的細胞接種至96孔板，細胞濃度為每孔1×104個細胞。待細胞貼壁后，加入鹽酸氟西汀，使其終濃度為10、1、0.1和0.01 μmol·L-1，每個濃度設6個復孔。將缺氧對照組和加藥組放入缺氧盒中缺氧處理18 h后，加入CCK-8，放入培養箱繼續培養1 h，在450 nm波長下測定吸光度(A)。根據A值高低篩選出鹽酸氟西汀作用的最佳藥物濃度。

1.2.6氧化產物含量和抗氧化酶活性檢測 從培養箱中取出培養皿，收集培養液用于檢測LDH活性。培養皿棄掉剩余培養基，用預冷的PBS洗細胞3次，大皿細胞加800 μL裂解液，中皿加300 μL裂解液，冰上裂解20 min，吸上清至1.5 mL的離心管中，4 ℃低溫離心機中，12 000 r·min-1離心15 min，取上清，分別檢測MDA含量和SOD、CAT酶活性，蛋白濃度采用BCA 法檢測。

1.2.7Western blot檢測相關蛋白的表達 從培養箱中取出細胞操作同上。在細胞裂解液中加入4×緩沖液，100 ℃沸水煮15 min，制備好的蛋白樣品-80 ℃備用。按每孔20 μg上樣，以5%濃縮膠、12%分離膠的SDS-PAGE分離蛋白，濕法將蛋白轉至PVDF膜上后，用5%脫脂牛奶封閉2 h后，孵一抗Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶500)、caspase-3(1 ∶2 000)、β-actin (1 ∶4 000)，在常溫下搖床孵育1 h后放入4 ℃冰箱過夜，洗膜，加入二抗，室溫孵育2 h，洗膜，化學發光法顯色，灰度值用 ImageJ 6.0軟件分析。

2 結果

2.1 PC12細胞的鑒定MAP2是神經元的特異性標記物，可作為神經元的標志性蛋白。本實驗使用綠色熒光標記的anti-MAP2抗體檢測PC12細胞的MAP2表達情況。結果PC12細胞染色呈陽性(Fig 1)，表明該PC12細胞為神經元樣細胞。

Fig 1 MAP2 protein expression in PC12 cells in vitro(×60)

2.2 鹽酸氟西汀對缺氧細胞存活率的影響與常氧對照 (Normoxia，Nor) 組相比(設定細胞存活率為100%)，缺氧模型 (Hypoxia，Hy) 組的細胞存活率活力僅為60%，低于Nor組(P<0.01)，表明細胞缺氧模型建立成功。鹽酸氟西汀 (Fluoxertine hydrochloride，FH) 各組均高于模型組(P<0.01)，以10-6mol·L-1最高，之后逐漸下降，說明在該濃度下細胞存活率最高，因此后續實驗均在該濃度下進行，見Fig 2。

Fig 2 Effect of fluoxetine on cell viability of PC12 cells

2.3 鹽酸氟西汀對乳酸脫酸酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性的影響LDH是公認的細胞損傷標志物。與Nor組相比，Hy組培養基中LDH含量明顯升高(P<0.01)，表明缺氧導致PC12細胞膜損傷，細胞內的LDH外泄到細胞培養液中。而與Hy組比，經鹽酸氟西汀處理后，LDH水平降低(P<0.01)，說明鹽酸氟西汀能夠維持細胞膜的完整性，減輕缺氧對PC12細胞的損傷，見Fig 3。

Fig 3 Effect of fluoxetine hydrochloride on hypoxia-induced LDH leakage in PC12

2.4 鹽酸氟西汀對氧化產物含量的影響活性氧(reactive oxygen species，ROS)和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)是最主要的氧化損傷指標。如Fig 4A所示，ROS染色后發綠色熒光，與Nor組相比，Hy組胞內ROS含量明顯增高，而FH組的ROS表達量沒有明顯增加，低于Hy,而與Nor組差異無統計學意義。MDA含量的變化與ROS相同,如圖Fig 4B。以上結果說明氟西汀可以有效緩解缺氧導致的胞內氧化損傷。

Fig 4 Effect of fluoxetine hydrochloride on ROS and MDA content level in PC12 cells under

2.5 鹽酸氟西汀對抗氧化酶活性的影響與Nor組相比，Hy組的CAT活性顯著降低(P<0.01)，但FH組并沒降低，且顯著高于Hy組(P<0.01)，而與Nor組處于同一水平(Fig 5A)。SOD活性的變化與CAT相似(Fig 5B)，表明鹽酸氟西汀能夠抵御缺氧造成的氧化損傷，顯著提高抗氧化酶活性。

Fig 5 Effect of fluoxetine hydrochloride on CAT content and SOD level in PC12 cells under

2.6 鹽酸氟西汀對細胞凋亡的影響與Nor組比較，Hy組中促凋亡蛋白Bax的表達量增加(P<0.01)，而抗凋亡蛋白Bcl-2和caspase-3下降。FH組與Hy組相比，促凋亡蛋白表達量下降而抗凋亡蛋白表達量上升(P<0.01),表明鹽酸氟西汀抑制缺氧導致的細胞凋亡(Fig 6)。

Fig 6 Effect of fluoxetine on expression of apoptosis-related protein hypoxia condition

3 討論

我國雖然擁有960萬平方米的陸地面積，但高原地區面積占國土面積的26.04%。高原地區氧含量稀薄，人在急進高原時，大腦不能適應高原地區氧含量的急劇變化，會由于供氧不足而出現視覺、記憶力、思維和注意力不同程度下降的癥狀，即發生所謂高原反應[4]。研究預防和治療高原反應對于在高原地區開展國防和經濟建設具有重大意義。目前市場上可供選擇的的抗高原缺氧藥物非常匱乏，美國FDA唯一批準的乙酰唑胺副作用較多，而中藥紅景天資源有限。因此，尋找新的療效好、副作用少的抗高原缺氧藥物是當務之急。

PC12細胞是大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤細胞，與神經元細胞具有相近的形態、結構和功能[5-6]，是體外實驗中模擬神經元功能的重要細胞株，我們利用實驗室已經建立成熟穩定的PC12缺氧損傷模型[7-8]研究發現，缺氧時PC12細胞內的LDH、ROS和MDA含量都相對增加，其中LDH的增加表明細胞在缺氧環境中受到損傷，ROS和MDA的增加表明缺氧后胞內發生氧化性損傷，抗氧化酶SOD和CAT活性的降低表明細胞抵抗氧化損傷的能力下降。氟西汀能夠抑制LDH、ROS和MDA的增加，提高SOD和CAT活性，表明其緩解了缺氧對PC12細胞造成的氧化性損傷。低氧導致PC12細胞中cleaved caspase-3和Bax的表達升高，Bcl-2的表達降低。氟西汀治療可抑制這種變化趨勢，減少細胞凋亡，改善PC12細胞在缺氧環境下的生存狀態。

雖然氟西汀是臨床常用的抗抑郁藥，但近年來的許多實驗研究證明，其對神經細胞損傷具有保護作用。氟西汀對于皮質酮造成的PC12細胞損傷的保護作用可能是通過提高FoxO3a、Akt和CREB表達及其磷酸化水平[9]。氟西汀對神經干細胞具有保護作用，其機制是上調神經營養因子的轉錄和翻譯，促進神經干細胞活化為星形膠質細胞，進而促進受損神經元組織的修復[10]。氟西汀具有抗炎作用，其作用機制可能是激活迷走神經抗炎途徑，從而減輕周圍神經組織和大腦中的炎癥反應。氟西汀和西酞普蘭的抗炎作用歸因于5-羥色胺依賴性和5-羥色胺非依懶性。本課題組在后續研究中發現，缺氧損傷后細胞內的5-羥色胺含量較常氧對照組升高，而給予鹽酸氟西汀后，5-羥色胺含量下降。說明氟西汀極有可能通過影響胞內5-羥色胺的含量來發揮其抗缺氧損傷活性。

綜上所述，本實驗首次發現氟西汀對體外培養缺氧細胞具有保護作用，其機制可能與氟西汀對胞內5-羥色胺含量的調節作用有關，但詳細機制還有待于進一步研究。本實驗結果提示氟西汀除作為抗抑郁藥外，還具有開發為抗缺氧損傷新藥的潛力，這也為抗高原缺氧藥物的研發提供了一條新思路。