黃芪多糖對(duì)抑郁大鼠海馬Nrf2-ARE通路的影響

宿宏佳，王冬梅，張 騰，張 翔，毛淑梅，李承德

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室、山東省高校重點(diǎn)應(yīng)用藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東 濰坊 261053；2.泰山護(hù)理職業(yè)學(xué)院藥理學(xué)教研室，山東 泰安 271000；3.濰坊醫(yī)學(xué)院臨床藥學(xué)教研室、山東省高校重點(diǎn)應(yīng)用藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東 濰坊 261053)

近年抑郁發(fā)病率逐年升高，臨床常用的5-HT再攝取抑制藥、三環(huán)類(lèi)藥物等，久用不良反應(yīng)較大。研究表明，氧化應(yīng)激反應(yīng)參與了抑郁的發(fā)生、發(fā)展[1]。Nrf2在機(jī)體調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)中具有重要作用，可與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，啟動(dòng)抗氧化酶的基因轉(zhuǎn)錄，形成Nrf2-ARE信號(hào)通路，調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激水平。報(bào)道顯示調(diào)控Nrf2-ARE通路活性可改善動(dòng)物的抑郁行為[2]。此外，資料證實(shí)海馬損傷與抑郁的發(fā)生有關(guān)，修復(fù)海馬損傷有利于改善機(jī)體抑郁行為[3]。黃芪提取物APS在多種疾病的動(dòng)物模型中顯示出抗氧化活性[4]，但APS是否可通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2-ARE通路改善海馬氧化應(yīng)激損傷，從而發(fā)揮抗抑郁作用，研究較少。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組健康雄性Wistar大鼠(SCXK魯20130001)，體質(zhì)量(200±20) g購(gòu)于山東魯抗公司。適應(yīng)性飼養(yǎng)后大鼠隨機(jī)分為4組：正常組(Control)、抑郁組(Depression)、APS低劑量組(APS-low)、APS高劑量組(APS-high)，每組10只。

1.2 藥品試劑與儀器Nrf2抗體(ab137550)、HO-1抗體(ab13248)：英國(guó)Abcam公司；SOD(A001-2)、MDA(A003-1)、GSH-Px(A005-1)、CAT(A007-1-1)試劑盒：南京建成公司；羊抗兔IgG(ZDR-5306)：北京Zsbio生物公司；APS(純度：70%)：廣東省惠州市東方公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(FSQ-101)：日本TOYOBO公司；擴(kuò)增試劑盒(204052)：德國(guó)QIAGEN公司；大鼠束縛盒、游泳箱、敞箱：根據(jù)文獻(xiàn)自制。

1.3 方法

1.3.1抑郁模型制備[5]除正常組外其余大鼠每天接受兩種慢性不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)，連續(xù)28 d。應(yīng)激包括：冷水強(qiáng)迫游泳、熱環(huán)境、晝夜節(jié)律改變、夾尾、軀體活動(dòng)束縛、傾斜鼠籠、禁水、進(jìn)食剝奪、噪音環(huán)境、電擊足底、潮濕墊料等。

1.3.2藥物治療 自大鼠接受CUMS開(kāi)始，予以200、400 mg·kg-1APS進(jìn)行治療，連續(xù)治療4周。其余大鼠予以等容量的溶劑。

1.3.3抑郁行為評(píng)價(jià) 糖水偏好評(píng)價(jià)， 根據(jù)文獻(xiàn)[5]，大鼠事先飲食剝奪、飲水剝奪24 h，然后進(jìn)行糖水偏好監(jiān)測(cè)：大鼠單籠飼養(yǎng)，鼠籠放置1瓶純水、1瓶1%蔗糖水，為排除位置偏好等因素干擾，每0.5 h更換一次兩瓶的位置，大鼠自由攝水2 h(上午8-10點(diǎn))，分別測(cè)定大鼠對(duì)兩種液體的攝取量，計(jì)算糖水偏好度。糖水偏好度/%=糖水消耗量/(純水消耗量+糖水消耗量)×100%

強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 大鼠于游泳箱(水迷宮設(shè)備的金屬圓筒：直徑100 cm，高度60 cm)中自由游泳5 min，水深35 cm、水溫(24-26) ℃，錄像并計(jì)時(shí)大鼠漂浮不活動(dòng)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)前1 d，讓大鼠練習(xí)游泳15 min。

懸尾實(shí)驗(yàn) 用膠帶綁縛大鼠尾部，懸掛于吊鉤6 min，頭距地面30 cm，錄像并計(jì)時(shí)后5 min不掙扎靜止時(shí)間。

1.3.4PCR檢測(cè) TRIzol法從大鼠海馬組織中提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(37 ℃ 15 min，95 ℃ 5 min)。PCR擴(kuò)增分采用引物Nrf2 5′-CTGGCT GATACTACCGCTGTT-3′(正向)、5′-GTGGAGAG GATGCTGCTGAA-3′(反向)，β-actin 5′-TCACCCA CACTGTGCCCCATCTACGA-3′(正向)、5′-CAGCGG AACCGCTCATTGCCAATGG-3′(反向)，擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s(40次循環(huán))。采用比較閾值循環(huán)(CT)法，用方程2-ΔΔCT進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.3.5Western blot檢測(cè) 分別提取海馬組織中總蛋白與核蛋白，取40 μg樣品電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉1 h，一抗溶液(Nrf2、HO-1、β-actin均為 1 ∶1 000)中孵育(4 ℃過(guò)夜)，洗滌后羊抗兔IgG溶液(1 ∶5 000)室溫孵育1 h，洗膜、顯影、定影，通過(guò)ImageJ進(jìn)行灰度分析，蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度/相應(yīng)β-actin條帶灰度。

1.3.6氧化應(yīng)激指標(biāo) 將海馬組織勻漿，用檢測(cè)試劑盒檢測(cè)海馬組織勻漿液中CAT、SOD、GSH-Px、MDA的水平。

1.3.7HE染色 10%多聚甲醛固定大鼠海馬組織，標(biāo)本常規(guī)蠟塊包埋、切片(厚4 μm)，進(jìn)行HE染色，光鏡下分析大鼠海馬的組織學(xué)變化，高倍鏡下計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量(每個(gè)樣本取15個(gè)視野，取均值)。

1.3.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 21.0軟件(美國(guó)IBM公司)對(duì)資料進(jìn)行單因素方差分析，各組間兩兩比較，分別采用Tukey HSD檢驗(yàn)(方差齊時(shí))或Dunnett T3檢驗(yàn)(方差不齊時(shí))。

2 結(jié)果

2.1 APS對(duì)抑郁行為的影響Tab 1顯示，抑郁組大鼠糖水偏好度明顯低于正常組(P<0.05)，且抑郁組大鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中漂浮不動(dòng)時(shí)間、懸尾實(shí)驗(yàn)中靜止不動(dòng)時(shí)間均較正常組明顯延長(zhǎng)(P<0.05)。與抑郁組比較，APS干預(yù)改善了抑郁大鼠的抑郁行為(P<0.05)；且APS高劑量組改善程度優(yōu)于APS低劑量組(P<0.05)。

Tab 1 Effects of APS on depressive behaviors of

2.2 APS對(duì)海馬Nrf2基因、Nrf2總蛋白、Nrf2核蛋白的影響由Fig 1可見(jiàn)，與正常組比較，抑郁組海馬Nrf2 mRNA、Nrf2總蛋白、Nrf2核蛋白升高(P<0.05)。與抑郁組比較，APS低、高劑量組海馬Nrf2 mRNA、Nrf2總蛋白、Nrf2核蛋白水平進(jìn)一步升高(均P<0.05)，且APS高劑量組上述物質(zhì)水平升高更為明顯(均P<0.05)。

Fig 1 Effects of APS on Nrf2 mRNA,Nrf2 and HO-1

2.3 APS對(duì)海馬氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響Fig 1D、Tab 2顯示，與正常組比較，抑郁組大鼠海馬勻漿液MDA水平明顯升高，而HO-1、SOD、GSH-Px、CAT水平則明顯降低(P<0.05)。與抑郁組比較，APS干預(yù)可明顯降低抑郁大鼠海馬MDA水平，升高HO-1、SOD、GSH-Px、CAT水平(P<0.05)，且APS高劑量組上述指標(biāo)的改善較APS低劑量組更為明顯(P<0.05)。

Tab 2 Effects of APS on hippocampal levels of oxidative

2.4 APS對(duì)海馬組織結(jié)構(gòu)變化的影響Fig 2顯示，正常組大鼠海馬的CA1區(qū)神經(jīng)元分布密集，細(xì)胞排列規(guī)則，未見(jiàn)明顯損傷。抑郁組大鼠CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量較正常大鼠減少(P<0.05)，且細(xì)胞排列欠規(guī)則，部分細(xì)胞的結(jié)構(gòu)不完整。與抑郁組比較，APS高劑量組大鼠CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量明顯增加(P<0.05)。

Fig 2 HE staining(×400)

3 討論

目前臨床常用抗抑郁藥可引起多種不良反應(yīng)，且臨床資料顯示對(duì)多種類(lèi)型的抑郁癥療效欠佳。近年學(xué)者在天然產(chǎn)物治療抑郁方面進(jìn)行了大量探索，多種中藥有效成分被證實(shí)具有抗抑郁活性，為抗抑郁新藥的發(fā)現(xiàn)開(kāi)辟了新途徑[6]。本研究采用CUMS對(duì)大鼠進(jìn)行刺激，采用強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)與懸尾實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠絕望程度進(jìn)行了評(píng)價(jià)，并對(duì)大鼠的快感缺乏表現(xiàn)進(jìn)行了監(jiān)測(cè)(糖水消耗實(shí)驗(yàn))，結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)多種慢性應(yīng)激性刺激后，大鼠呈現(xiàn)絕望表現(xiàn)、且存在快感缺乏，表明大鼠存在抑郁行為；經(jīng)APS干預(yù)后，大鼠的絕望程度及快感消失得到顯著改善。上述行為學(xué)變化表明APS干預(yù)可改善大鼠的抑郁行為，但APS抗抑郁的機(jī)制，目前尚未明了。

大腦海馬與機(jī)體的情緒調(diào)節(jié)有關(guān)，研究表明抑郁模型動(dòng)物的海馬往往存在組織損傷，藥物改善海馬損傷后，抑郁行為減輕，故改善抑郁機(jī)體海馬病變被認(rèn)為是一項(xiàng)有效的抗抑郁措施[3]。本研究顯示，大鼠經(jīng)過(guò)CUMS刺激后，海馬發(fā)生病理?yè)p傷，這與既往報(bào)道一致[3]。而經(jīng)APS干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)大鼠海馬損傷明顯減輕。鑒于海馬在情緒調(diào)節(jié)中的重要作用，推測(cè)APS的抗抑郁活性可能與保護(hù)海馬有關(guān)。

CUMS刺激誘發(fā)海馬損傷及抑郁行為的機(jī)制復(fù)雜，其中氧化應(yīng)激異常增強(qiáng)被認(rèn)為是關(guān)鍵因素之一。除CUMS誘發(fā)的抑郁模型外，其他多種抑郁動(dòng)物模型及抑郁患者亦被證實(shí)存在過(guò)強(qiáng)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，而動(dòng)物及臨床試驗(yàn)則證實(shí)抑制過(guò)強(qiáng)的氧化應(yīng)激可減輕機(jī)體抑郁行為，是治療抑郁的重要策略之一[7-8]。中藥及提取物具有多作用靶點(diǎn)的特性，研究表明APS在多種疾病模型中具有抗氧化作用[9]，但APS是否在抑郁機(jī)體海馬中發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，尚未見(jiàn)研究報(bào)道。體內(nèi)MDA含量可反映機(jī)體氧自由基水平；SOD、GSH-Px、CAT等酶則在體內(nèi)發(fā)揮重要的抗氧化作用，上述物質(zhì)水平失衡可誘發(fā)多種疾病。本研究中抑郁大鼠海馬MDA水平較正常組升高，而海馬SOD、GSH-Px、CAT水平降低，表明抑郁大鼠海馬存在過(guò)強(qiáng)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。而經(jīng)APS干預(yù)后，大鼠SOD、GSH-Px、CAT水平較正常組升高，但MDA水平明顯降低，表明本研究中APS下調(diào)了抑郁大鼠海馬組織中的氧化應(yīng)激水平。除上述抗氧化酶外，HO-1亦是機(jī)體防御氧化應(yīng)激的重要機(jī)制之一，其表達(dá)水平降低時(shí)機(jī)體抗氧化能力下降，其表達(dá)異常參與了多種疾病的發(fā)生，而上調(diào)HO-1表達(dá)可改善氧化應(yīng)激引起的機(jī)體損傷[11]。新近幾項(xiàng)研究顯示，HO-1也參與了抑郁的發(fā)病[12]。本研究表明CUMS顯著降低了抑郁大鼠海馬HO-1的表達(dá)水平，可能因HO-1清除大鼠體內(nèi)異常增多的氧化物質(zhì)被消耗所致；而APS干預(yù)可顯著增加其表達(dá)。上述結(jié)果表明APS可通過(guò)多途徑調(diào)控抑郁大鼠海馬氧化應(yīng)激反應(yīng)。鑒于氧化應(yīng)激反應(yīng)在海馬損傷及抑郁中的作用，推測(cè)APS的海馬保護(hù)作用及抗抑郁作用可能與其抑制CMUS誘發(fā)的海馬氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

上述抗氧化酶系的表達(dá)受多種因素調(diào)控，其中Nrf2被認(rèn)為是一個(gè)重要的調(diào)控抗氧化酶系的轉(zhuǎn)錄因子[13]，參與了腫瘤、炎癥、免疫性疾病、內(nèi)分泌疾病等的發(fā)病與轉(zhuǎn)歸[14-15]。現(xiàn)有理論認(rèn)為，keap1為Nrf2的抑制蛋白，通常情況下二者結(jié)合使Nrf2的活性被抑制；當(dāng)機(jī)體存在過(guò)強(qiáng)的氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，活性氧等引起keap1構(gòu)象變化，Nrf2被解除抑制、并由細(xì)胞漿移位進(jìn)入細(xì)胞核，在核內(nèi)與ARE結(jié)合，使ARE調(diào)控的SOD、GSH-Px、CAT、HO-1等抗氧化酶的基因表達(dá)增加，從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。本研究中抑郁組大鼠海馬Nrf2基因、Nrf2總蛋白及核蛋白較正常組表達(dá)增加，可能為CUMS引起大鼠氧化應(yīng)激水平增高，過(guò)強(qiáng)的氧化應(yīng)激反饋性激活Nrf2，對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮調(diào)控作用，但自然狀態(tài)下機(jī)體內(nèi)在的反饋性調(diào)節(jié)作用相對(duì)較弱，不能有效地對(duì)抗體內(nèi)存在的過(guò)強(qiáng)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。與本研究結(jié)果類(lèi)似，文獻(xiàn)中多種氧化應(yīng)激疾病模型存在Nrf2被激活的現(xiàn)象[15]。本研究采用APS對(duì)抑郁大鼠進(jìn)行了干預(yù)，結(jié)果顯示，與抑郁組比較，APS干預(yù)提升了抑郁大鼠海馬Nrf2基因、Nrf2總蛋白及核蛋白水平，該結(jié)果表明APS可增加抑郁大鼠Nrf2表達(dá)并促進(jìn)Nrf2活化和向核內(nèi)轉(zhuǎn)位，增強(qiáng)大鼠的抗氧化應(yīng)激機(jī)制。結(jié)合上述APS對(duì)SOD、GSH-Px、CAT、HO-1等的作用，可見(jiàn)APS激活了抑郁大鼠海馬的Nrf2-ARE通路。

綜上所述，APS可劑量依賴性的改善抑郁大鼠的海馬損傷及抑郁行為，其作用可能與激活大鼠Nrf2-ARE通路有關(guān)。