大豆苷元對人成骨樣MG-63細胞OPG及RANKL表達的調節作用

王 川，祁 琳，陳雨萌，王 越，黃宗堂

(1.天津醫科大學朱憲彝紀念醫院、天津市內分泌研究所、國家衛健委激素與發育重點實驗室、天津市代謝性疾病重點實驗室，天津 300134；2.武警特色醫學中心藥劑科，天津 300162；3.天津醫科大學藥學院 天津 300050；4.天津中醫藥大學中西醫結合學院， 天津 301617；5.深圳豐澤康生物科技有限公司， 廣東 深圳 518000)

在口腔種植手術過程中經常會遇到因頜骨骨質疏松致種植區骨密度降低而影響種植體植入后的初期穩定性。在牙種植體植入時種植體能夠獲得初期穩定性是至關重要的，而對于絕經后女性，不僅雌激素分泌較少，還會導致護骨素(osteoprotegerin，OPG)水平下降，核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)水平升高。這些影響骨代謝因子改變，即OPG降低，RANKL和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)升高會導致成骨功能下降，破骨細胞功能上升，骨小梁稀疏，引起骨質流失，骨量減少。所以，雌激素的缺乏是導致絕經后骨質疏松(postmenopausal osteoporosis，PMOP)的根本原因。因而，尋找切實有效的藥物用于治療PMOP以提高牙種植體植入術的成功率成為現階段的研究熱點。

雌激素替代治療PMOP療效較好，但毒副作用明顯[1]。植物激素是一類與雌激素結構和功能類似，能選擇性的與雌激素受體(estrogen receptor，ER)結合，從而發揮弱雌激素樣活性。近年來，大豆異黃酮抗骨質疏松作用引起廣泛關注。大豆苷元是大豆異黃酮的的主要成分之一，與17β-雌二醇(17 β-estradiol，E2)具有相似的結構，能與ER結合發揮弱雌激素樣作用。有研究表明，大豆苷元能夠增加小鼠成骨細胞中ALP活性，顯著減少去卵巢大鼠的骨質流失，增加骨密度[2]。而且我們的前期實驗結果顯示[3]，大豆苷元可以通過抑制人成骨樣MG-63細胞分泌白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)，阻止破骨細胞形成，以產生抗骨質疏松的作用。本研究仍以人成骨樣MG-63細胞為研究對象，繼續探索大豆苷元對OPG及RANKL表達的調節作用，旨在進一步探究大豆苷元抗骨質疏松作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑大豆苷元(純度>98%)購自中國藥品生物制品檢定所(北京)(批號：27394)；人成骨樣MG-63細胞系購自ATCC(美國)；胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)購自中美合資蘭州民海生物工程有限公司(批號：27394)；DMEM高糖培養基購自Gibco公司(美國)(批號：1645780)、純ER阻斷劑ICI 182780(批號：D0005215)、E2購自Sigma公司(美國)批號：012K9810V)；文中所用引物購自金斯瑞生物科技有限公司(南京)；瓊脂糖購自Promega公司(美國)(批號：172155)；脂質體LipofectamineTM2000DE(批號：947027)、TRIzol購自Invitrogen(美國)；2×Premix Taq(批號：AK5004)、2×PCR Mixture 購自TaKaRa(批號：F0910038)；BCA試劑盒購自Pierce公司(美國)(批號：OB184645)等。

1.2 方法

1.2.1細胞株和細胞培養 人成骨樣MG-63細胞使用含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的DMEM高糖培養液，在5% CO2、37 ℃培養箱中培養，平均2 d更換1次培養液，3-4 d進行1次傳代。

1.2.2細胞轉染 按照LipofectamineTM2000DE說明書進行，將pGenesil-ERα shRNA、pGenesil-ERβ shRNA、pGenesil-scra-mbled shRNA分別轉染至成人成骨樣MG-63細胞中，按照文獻[4]所述，經過G418加壓篩選構建穩定轉染的MG-63/ERα shRNA、MG-63/ERβ shRNA、MG-63/scrambled shRNA 細胞株。

1.2.3藥物處理 取對數生長期的MG-63細胞培養24 h，棄培養液，換含1%FBS的DMEM高糖培養基培養24 h同步化細胞，分別加入不同終濃度的大豆苷元(0.01、0.1、1 μmol·L-1)、Raloxifene(0.1 μmol·L-1)、E2(0.1 μmol·L-1)、DMSO，恒溫箱培養48 h。

ER阻斷劑處理細胞：先使用10 μmol·L-1的ER阻斷劑ICI 182780，37 ℃孵育30 min，然后加入大豆苷元(0.1 μmol·L-1)，并設ICI 182,780對照組。

1.2.4RT-PCR 細胞接種于6孔板中(2.5×108個·L-1)，2 mL/孔，按上述方法處理細胞，提取RNA，逆轉錄后行RT-PCR反應。PCR反應體系為20 μL，PCR反應條件：預變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s，退火59 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 1 min，34個循環；72 ℃延伸 10 min。取PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統觀察拍照，Quantity One軟件進行分析，以靶基因/β-actin光密度比值作為mRNA的相對表達水平。

1.2.5Western blot 調整細胞濃度至7.5×108·L-1，取2 mL接種于60 mm培養皿中，按照上述方法處理細胞，提取蛋白，按照BCA蛋白檢測試劑盒說明書操作進行蛋白定量，蛋白SDS-PAGE電泳，然后將蛋白從SDS-PAGE膠上轉移至PVDF膜免疫檢測，經X-ray底片曝光，Scion Image軟件分析，以β- actin作內參，以靶基因/β-actin的灰度值作蛋白相對表達豐度。

1.2.6引物序列 OPG：Sense：5′-GCTAACCTCAC CTTCGAG-3′，Antisense：5′-TGATTGGACCTGGTT ACC-3′；RANKL ：Sense：5′-AACAGGCCTTTCAAGG AGCTGTGC-3′,Antisense：5′-AAGAGGACAGACTCA CTTTATGGGG-3′；β-actin：Sense：5′-ACACTGTGTT CAACTACCCCGAG-3′,Antisense：5′-TAAAACGCA GCTCAGTAACAGTCC-3′；ERα：Sense：5′-ACACTGT GTTCAACTACCCCGAG-3′,Antisense：5′-CAGGCTG TTGGGACTGAAGG-3′；ERβ：Sense：5′-TCTGTCC AGCCACGAATCAG-3′,Antisense：5′-AGCTTTTACG CCGGTTCTTG-3′。

1.2.7質粒 pGenesil-ERα-siRNA、pGenesil-ERβ-siRNA、pGenesil-scramble—siRNA 3種質粒均由武漢晶賽生物科技公司設計、合成，都是以pGenesil-1為載體，載體帶有CMV啟動子，能表達增強型綠色熒光蛋白的真核表達。3種質粒的DNA模板序列如下： pGenesil-ERα-siRNA：Sense：CTCATCCTCTC CCACATCA，Loop：TTCAAGACG，Antisense：TGATG TGGGAGAGGATGAG；pGenesil-ERβ-siRNA：Sense：GCCCTGCTGTGATGAATTA，Loop：TTCAAGACG，Antisense：TA ATTCATCACAGCAGGGC；pGenesil-scramble-siRNA：Sense：GACTTCATAAGGCGCATGC，Loop：TTCAAGACG，Antisense：GCATGCGCCTTATGAAGTC。

1.2.8抗體 OPG：小鼠單克隆抗體，購自Santa Cruz，稀釋比，1 ∶200；RANKL：小鼠單克隆抗體，購自Santa Cruz，稀釋比，1 ∶200；β-actin：小鼠單克隆抗體，購自Sigma USA，稀釋比，1 ∶2 000。

1.2.9統計學處理 應用SPSS統計軟件包進行統計學分析，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。用GraphPad Prism 5軟件進行圖表處理。

2 結果

2.1 大豆苷元促進MG-63細胞OPG mRNA和蛋白的表達與Control組相比較，使用大豆苷元(0.01、0.1、1 μmol·L-1)及陽性對照藥物(0.1 μmol·L-1Raloxifene及0.1 μmol·L-1E2)處理MG-63細胞觀察OPG mRNA和蛋白的表達水平，發現不同濃度的大豆苷元均可促進MG-63細胞OPG mRNA和蛋白的表達水平，其中以0.1 μmol·L-1濃度促進效果最為明顯(P<0.05)。同時，陽性對照藥物(0.1 μmol·L-1Raloxifene及0.1 μmol·L-1E2)均能明顯促進MG-63細胞OPG mRNA和蛋白的表達水平。見Fig 1,2。

Fig 1 Expression of OPG mRNA detected by

Fig 2 Expression of OPG protein detected by

2.2 大豆苷元抑制MG-63細胞RANKL mRNA和蛋白的表達與Control組相比較，使用大豆苷元(0.01、0.1、1 μmol·L-1)及陽性對照藥物(0.1μmol·L-1Raloxifene及0.1 μmol·L-1E2)處理MG-63細胞觀察RANKL mRNA和蛋白的表達水平，發現不同濃度的大豆苷元均可抑制MG-63細胞RANKL mRNA的表達水平，其中以0.1 μmol·L-1濃度抑制效果最為明顯(P<0.01)，而大豆苷元濃度為1 μmol·L-1時蛋白的表達水平最低(P<0.01)。同時，陽性對照藥物(0.1 μmol·L-1Raloxifene及0.1μmol·L-1E2)也均能抑制RANKL mRNA和蛋白的表達水平(P<0.05)，見Fig 3,4。

Fig 3 Expression of RANKL mRNA detected by

Fig 4 Expression of RANKL protein detected by

上述結果提示，大豆苷元可以促進OPG mRNA和蛋白的表達并抑制RANKL mRNA和蛋白的表達，其作用效果與Raloxifene和E2類似。

2.3 經大豆苷元作用后MG-63細胞OPG/RANKL比值與Control組相比較，大豆苷元處理組(0.01、0.1、1 μmol·L-1)及陽性對照藥物Raloxifene(0.1 μmol·L-1)及E2(0.1 μmol·L-1)處理組OPG/RANKL比值升高,見Fig 5,6。

Fig 5 Ratio of OPG / RANKL mRNA

Fig 6 Ratio of OPG / RANKL protein

2.4 ER阻斷劑對大豆苷元OPG和RANKL轉錄活性的阻斷作用為了觀察大豆苷元對MG-63細胞OPG和RANKL表達的調節作用是否由ER途徑介導，本研究在加入大豆苷元(0.1 μmol·L-1)前30 min，先加入ER阻斷劑ICI 182780(100 μmol·L-1)處理MG-63細胞，經RT-PCR和Western blot方法來檢測OPG和RANKL的mRNA和蛋白的表達水平。如Fig 7-10所示，ICI 182780可阻斷大豆苷元對MG-63細胞OPG表達的上調作用(P<0.05)，可阻斷大豆苷元對MG-63細胞RANKL表達的下調作用(P<0.05)，單獨ICI 182780作用不影響大豆苷元對MG-63細胞OPG及RANKL的表達水平(P>0.05)。

Fig 7 The blocking effect of ER blocker on Daidzein induced OPG mRNA expression detected by RT-PCR

Fig 8 The blocking effect of ER blocker on Daidzein induced OPG protein expression detected by Western blot

Fig 9 The blocking effect of ER blocker on Daidzein induced RANKL mRNA expression detected by RT-PCR

Fig 10 The blocking effect of ER blocker on Daidzein induced RANKL protein expression detected by Western blot

2.5 大豆苷元對MG-63細胞OPG的促進作用、RANKL的抑制作用是由ERα 和ERβ共同介導的如Fig 11,12所示，與parental對照組、scrambled shRNA對照組(scrambled shRNA細胞是向MG-63細胞中轉染空載體，作為干擾的空白對照)相比，大豆苷元對MG-63/ERα shRNA和MG-63/ERβ shRNA細胞OPG和RANKL的mRNA和蛋白的表達水平無影響(P>0.05)，見Fig 11,12。

Fig 11 Effects of Daidzein on expression of OPG and RANKL mRNA in MG-63/ERα shRNA and MG-63/ERβ shRNA cells detected by RT-PCR

Fig 12 Effects of Daidzein on OPG and RANKL protein expression in MG-63 / ERα shRNA and MG-63/ERβ shRNA cells detected by Western blot

3 討論

腫瘤壞死因子家族的NF-κB受體激活子RANKL在口腔的牙胚、牙囊、牙周組織、骨組織及慢性炎癥組織區域中可檢出，其受體RANK和OPG組成的RANKL-RANK-OPG軸參與調節骨吸收與骨生成平衡。RANKL與破骨前體細胞或成熟破骨細胞膜上的RANKL結合，刺激破骨細胞分化、活化及抑制破骨細胞凋亡[5]，引起骨吸收的發生。OPG是TNF超家族成員，可作為RANKL的誘騙受體與RANK結合，競爭性的抑制RANKL與RANK結合，抑制破骨細胞分化、成熟及骨量增加。

本研究以人成骨樣MG-63細胞作為研究對象，因其具有特征性成骨細胞功能，并能同時表達ERα和ERβ。絕經后不僅雌激素分泌減少，還會導致OPG水平下降，RANKL水平升高，導致骨質流失，骨量減少，骨小梁稀疏。雌激素替代治療PMOP療效較好，但毒副作用明顯[6]。植物激素是一類與雌激素結構和功能類似，能選擇性的與ER結合，從而發揮弱雌激素樣活性。大豆苷元是大豆異黃酮的的主要成分之一，與17β-雌二醇(E2)擁有相似的結構，能與ER結合發揮弱雌激素樣作用。經研究，大豆苷元具有抗炎[7]、抗氧化[8-9]、抑制腫瘤細胞增殖及遷移[8, 10]。因此，我們實驗用大豆苷元作用于MG-63細胞，觀察OPG、RANKL的mRNA及蛋白的表達水平，探索大豆苷元抗骨質疏松的分子機制。

本研究結果表明，大豆苷元能促進MG-63細胞OPG mRNA和蛋白的表達且能抑制MG-63細胞RANKL mRNA和蛋白的表達。我們在實驗中發現，不同濃度的大豆苷元及陽性對照藥物(0.1 μmol·L-1Raloxifene及0.1 μmol·L-1E2)均可促進MG-63細胞OPG mRNA和蛋白的表達水平，其中濃度為0.1 μmol·L-1大豆苷元促進效果最為明顯。不同濃度的大豆苷元及陽性對照藥物(0.1 μmol·L-1Raloxifene及0.1 μmol·L-1E2)均可抑制MG-63細胞RANKL mRNA和蛋白的表達水平，其中以0.1 μmol·L-1濃度抑制效果最為明顯(P<0.01)，而大豆苷元濃度為1 μmol·L-1時蛋白的表達水平最低(P<0.01)。因此，我們認為大豆苷元能夠通過促進MG-63細胞OPG表達、抑制RANKL表達，從而能夠實現抗骨質疏松的作用。

OPG/RANKL比值可作為評價細胞成骨作用的指標。骨質疏松癥患者骨組織OPG與RANKL的比值遠遠低于正常骨組織。根據Liu等[11]、Kapasa等[12]研究表明，OPG可顯著增加種植體周圍骨結合，通過增加種植體周圍OPG的表達或提高OPG/RANKL的比值可顯著增加口腔種植的成功率。因此，我們計算了經大豆苷元作用后MG-63細胞OPG/RANKL比值。結果顯示，與Control組相比較，大豆苷元處理組(0.01、0.1、1 μmol·L-1)及陽性對照藥物Raloxifene(0.1 μmol·L-1)及E2(0.1 μmol·L-1)處理組OPG/RANKL比值升高。這提示，加入大豆苷元可增加成骨細胞介導能力，能起到抑制骨質疏松的作用。

有研究表明[13]，E2能與ER結合發揮弱雌激素樣作用，其抗骨質疏松機制是通過促進成骨細胞OPG表達、抑制RANKL表達實現的。最近有研究表明[14]，大豆苷元可以通過ER途徑激活mTOR上調Cyclin D1和SREBP-1c的表達。那么大豆苷元是否也是通過ER途徑實現對MG-63細胞OPG、RANKL mRNA及蛋白的表達的影響呢？為了觀察大豆苷元對MG-63細胞OPG和RANKL表達的調節作用是否由ER途徑介導，我們在加入大豆苷元(0.1μmol·L-1)前30min，先加入ER阻斷劑ICI 182780 (100 μmol·L-1)處理MG-63細胞，經RT-PCR和Western blot方法來檢測OPG和RANKL的mRNA和蛋白的表達水平。結果顯示，ICI 182780可阻斷大豆苷元對MG-63細胞OPG表達的上調作用，可阻斷大豆苷元對MG-63細胞RANKL表達的下調作用，單獨ICI 182780作用不影響大豆苷元對MG-63細胞OPG及RANKL的表達水平，這提示大豆苷元對MG-63細胞OPG和RANKL的表達的調節作用是經ER途徑介導的。

為進一步確認大豆苷元是經過ER何種亞型發揮調節作用的，本研究采用shRNA技術分別沉默了ERα 和ERβ的表達，然后采用RT-PCR和Western blot技術檢測大豆苷元對MG-63細胞及其穩定轉染克隆的OPG和RANKL的mRNA和蛋白的表達水平。結果顯示，與parental對照組、scrambled shRNA對照組相比，大豆苷元對MG-63/ERα shRNA和MG-63/ERβ shRNA細胞OPG、RANKL的mRNA和蛋白的表達水平影響差異無顯著性。因此，大豆苷元對MG-63細胞OPG的促進作用、RANKL的抑制作用是由ERα和ERβ共同介導的。

綜上，本研究對大豆苷元對MG-63細胞OPG和RANKL表達及其作用機制作了初步探討。實驗結果表明，大豆苷元可以通過ERα 和ERβ途徑促進MG-63細胞OPG的mRNA和蛋白的表達、抑制RANKL的mRNA和蛋白的表達，從而減少骨質吸收，改善骨密度，緩解骨質疏松。因此，大豆苷元可為防治骨質疏松提供理論基礎，為新藥的開發提供依據，進而為中老年骨質疏松患者提供口腔種植體植入適合的條件，以增加口腔種植義齒修復的成功率。