張釜于，曾煉，羅昭，桑明，孫曉東，羅輝宇

(湖北醫藥學院附屬襄陽市第一人民醫院1.麻醉科；2.中心實驗室；3.帕金森臨床研究中心；4.武當特色中藥研究湖北省重點實驗室，襄陽 441000)

羅哌卡因是臨床上應用廣泛的局部麻醉(局麻)藥[1-2]，但應用于椎管內麻醉時可能引起短暫神經綜合征和馬尾綜合征等神經損傷癥狀[3-4]，甚至產生永久的運動及感覺異常，這與其對脊髓神經元的毒性密切相關[5]。羅哌卡因引起神經毒性的機制目前尚不清楚，其中神經元凋亡增多是重要基礎[6]。研究發現，羅哌卡因可以導致線粒體膜去極化，提高細胞內pH值，引起細胞色素C的釋放，通過凋亡誘發神經毒性[7]。除線粒體途徑外，還有報道羅哌卡因可誘導細胞中多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1[poly (CADP-ribose)polymerase-1，PARP-1]活化和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)耗竭，啟動caspase非依賴的凋亡，引起神經毒性[8]。

Fas/FasL是死亡受體途徑中介導外源性細胞凋亡的重要分子。其中Fas又稱作APO-1/CD95，屬于腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor ，TNF)受體家族重要成員，廣泛表達于多種組織和細胞中，多見于活化的淋巴細胞，其在細胞凋亡和免疫調節中發揮重要作用。Fas與Fas配體(Fas ligand，FasL)結合可激活Fas相關死亡結構域(Fas associated death domain，FADD)和procaspase-8，活化caspase-3[9]，最終導致細胞凋亡。Fas/FasL被證明在羅哌卡因處理的PC12細胞中表達上調[10]，并可在脊髓外傷中誘導神經元凋亡[9，11]，但其在局麻藥引起的脊髓神經元毒性中作用尚不明確。本實驗通過鞘內注射不同濃度羅哌卡因，探究Fas/FasL是否與羅哌卡因誘導的大鼠脊髓背角細胞凋亡有關。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取清潔級健康雄性SD大鼠25只，體質量180～200 g，6～8周齡，由湖北醫藥學院實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號： SCXK(鄂)2016-008。置于適宜環境，溫度：(22±2)℃，相對濕度：50%～60%，每天光照12 h，自由進食水，適應性飼養1周。實驗由襄陽市第一人民醫院動物倫理委員會批準，倫理審查編號：2018DW003。

1.2主要試劑與儀器 鹽酸羅哌卡因(江蘇恒瑞醫藥公司，純度>98%，批號：200115CA)；PE-10導管(Smith medical公司，批號：800/100/100)；Tunel染色試劑盒(Roche公司，批號：11684817910)；DAPI染液(批號：G1012)和兔抗大鼠 Fas、FasL多克隆抗體(批號：GB11089、GB11090-1)均購自Servicebio公司；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天生物技術有限公司，批號：C0105)；EVF3型電子測痛儀(Von Frey公司)；IX-71型倒置熒光顯微鏡(Olympus公司)；RM2016型病理切片機(上海徠卡公司)。

1.3動物分組、模型制作及給藥 按照隨機數字表法分為空白對照組、模型對照組及羅哌卡因小、中、大劑量組(0.5%，1%，2%)，每組5只。除空白對照組外，其余各組大鼠均進行鞘內置管。大鼠鞘內置管模型的制作：稱定質量后，除空白對照組外，其余4組大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.35 g·kg-1麻醉。參照文獻[12]方法，將無菌的PE10導管沿硬脊膜破口置入蛛網膜下2 cm，導管內可見腦脊液回流證明置管成功。充分沖洗導管后，逐層縫合，并將導管沿皮下固定至頸后。觀察大鼠術后恢復情況，排除術后出現下肢活動異常的大鼠。模型制作完成，在造模后第3天，使用微量注射器鞘內注射1%利多卡因20 μL，并予以0.9%氯化鈉溶液10 μL沖洗導管，若大鼠在30 s內出現雙側下肢麻痹、躲避反射和夾尾反射消失，同時雙上肢反射存在，并能2 h內恢復，則證明利多卡因篩選實驗陽性，模型制作成功。參照文獻[13]，對造模成功大鼠鞘內分別注射0.9%氯化鈉溶液和羅哌卡因(濃度分別為0.5%，1%和2%)，注射劑量均為0.12 mL·kg-1，注射時間12 h，每間隔1.5 h注射一次，共8次。空白對照組無處理。

1.4行為學觀察 采用電子測痛儀檢測大鼠機械性縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)。操作如下：將待測大鼠置于底部打孔的有機玻璃箱中，底部為鐵絲網，使其適應環境15 min，使用電子測痛儀探針刺激大鼠后足掌部皮膚，逐漸加壓；當大鼠出現縮足反應時，儀器自動記錄引起縮足所需的刺激大小，即為大鼠MWT。每只大鼠進行3次檢測，每次檢測間隔15 min，分別在造模前1 d、給藥前(造模后3 d)和鞘內給藥24 h后進行測量。

1.5組織取材與HE染色 給藥完畢后24 h，腹腔注射大鼠10%水合氯醛0.35 g·kg-1麻醉，處死后剪開脊柱，取脊髓腰膨大組織，加入4%多聚甲醛固定12 h，蠟塊包埋，組織切片，依據試劑盒說明書完成HE染色，光鏡下觀察脊髓組織結構的完整性，比較各組形態學改變。

1.6TUNEL染色 組織切片脫蠟至水，進行抗原修復和破膜。按試劑盒說明書取TUNEL試劑覆蓋組織，37 ℃水浴鍋孵育2 h，后用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值7.4)洗滌3次，每次5 min。去除PBS后，加DAPI染液避光，室溫孵育10 min復染細胞核，最后用抗熒光淬滅封片劑封片，使用倒置熒光顯微鏡(200倍)觀察切片并采集圖像，每組選取脊髓背角3個隨機視野，統計TUNEL染色陽性細胞比例。

1.7免疫組織化學 各組包埋的蠟塊切片脫蠟至水。切片抗原修復后予以PBS洗滌3次，用3%過氧化氫溶液阻斷內源性過氧化物酶。切片在3% BSA室溫封閉30 min，分別加入Fas抗體(1：200)、FasL抗體(1：500)孵育；洗滌后加入一抗相應種屬辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1：200)，室溫孵育50 min。玻片置于PBS洗滌3次，加入DAB顯色液，自來水沖洗切片終止顯色。蘇木精復染細胞核，裱片、熒光封片劑封片。每組選取4個隨機視野，顯微鏡下(400倍)觀察并采集圖像，使用ImageJ軟件計算視野下平均光密度。

2 結果

2.1MWT檢測值 與空白對照組比較，各模型組大鼠造模前后MWT均差異無統計學意義(P>0.05)。模型對照組和羅哌卡因小劑量組給藥24 h后，MWT與給藥前比較差異無統計學意義(P>0.05)，羅哌卡因中、大劑量組MWT較給藥前升高明顯，差異有統計學意義(P<0.05)，提示高濃度羅哌卡因易引起感覺異常的神經損傷癥狀。見表1。

表1 5組大鼠機械性縮足反射閾值

2.2對大鼠脊髓神經元凋亡的影響 低倍鏡(40×)下TUNEL熒光染色結果，顯示各組中大鼠脊髓組織輪廓清晰。高倍鏡(×200)下，空白對照組和模型對照組中僅存在少量凋亡細胞，差異無統計學意義(P>0.05)；羅哌卡因組均可在脊髓背角見到明顯增多的凋亡細胞，見圖1。與模型對照組比較，羅哌卡因組高倍視野下脊髓背角凋亡細胞比例增大，差異有統計學意義(P<0.05)；與羅哌卡因小劑量組比較，羅哌卡因大劑量組凋亡細胞比例增大，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.3脊髓組織形態改變 HE染色可見各組脊髓組織結構較為完整。空白對照組和模型對照組脊髓背角中神經元形態良好，核膜完整，細胞核深染致密，灰質白質清晰，神經細胞排列均勻，未見明顯的炎性細胞浸潤。羅哌卡因小劑量組可見脊髓背角間質輕度水腫，少量空泡形成；羅哌卡因中、大劑量組中脊髓背角間質水腫明顯，大量空泡形成并可見部分神經元核膜溶解，細胞核固縮、溶解、消失。見圖3。

A.空白對照組；B.模型對照組；C.羅哌卡因小劑量組；D.羅哌卡因中劑量組；E.羅哌卡因大劑量組。

A.空白對照組；B.模型對照組；C.羅哌卡因小劑量組；D.羅哌卡因中劑量組；E.羅哌卡因大劑量組。①與模型對照組比較，t=3.51～11.97，P<0.05；②與羅哌卡因小劑量組比較，t=4.36，P<0.05。

2.4脊髓組織中Fas、FasL表達的影響 Fas、FasL免疫組化陽性表達主要表現為神經元胞質著色，呈棕褐色的顆粒沉著。空白對照組與模型對照組中大鼠脊髓灰質背角細胞中僅有極低Fas和FasL表達，表達水平差異無統計學意義。與模型對照組比較，羅哌卡因組脊髓組織中Fas表達水平均升高(P<0.05)；與羅哌卡因小劑量組和羅哌卡因中劑量組比較，羅哌卡因大劑量組Fas表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)。僅羅哌卡因大劑量組FasL表達明顯高于模型對照組(P<0.05)，見圖4，圖5。

3 討論

神經損傷是局麻藥應用于臨床麻醉的并發癥之一[14]，傳統治療方法恢復過程緩慢，療效不理想，且無明確的預防措施。針對神經損傷，局麻藥引起神經毒性的機制一直是重要的研究方向。本實驗選取成年雄性SD大鼠制作鞘內置管模型，通過鞘內給予不同濃度羅哌卡因模擬臨床中長時間椎管內麻醉，探究局麻藥引起神經損傷的可能機制。結果顯示，與鞘內給藥前比較，1% 和2% 濃度羅哌卡因處理24 h后，大鼠后足MWT明顯上升；與模型對照組比較，鞘內注射羅哌卡因后，脊髓背角間質明顯水腫、空泡增多，背角細胞的凋亡水平隨羅哌卡因濃度增加而增加，提示高濃度羅哌卡因更易誘導脊髓神經元的凋亡并引起感覺異常等神經損傷癥狀；同時羅哌卡因處理組中Fas、FasL表達水平較模型對照組明顯增加，呈劑量依賴。由此推斷：Fas/FasL可能參與羅哌卡因誘導大鼠脊髓背角細胞凋亡的過程。

A.空白對照組；B.模型對照組；C.羅哌卡因小劑量組；D.羅哌卡因中劑量組；E.羅哌卡因大劑量組。

A.空白對照組；B.模型對照組；C.羅哌卡因小劑量組；D.羅哌卡因中劑量組；E.羅哌卡因大劑量組。

A.空白對照組；B.模型對照組；C.羅哌卡因小劑量組；D.羅哌卡因中劑量組；E.羅哌卡因大劑量組。①與模型對照組比較，t=5.26～10.10，P<0.05；②與羅哌卡因小劑量組比較，t=3.17，P<0.05；③與羅哌卡因中劑量組比較，t=3.67，P<0.05。

針對調控Fas/FasL的表達，近期研究發現，通過siRNA干擾p38 MAPK可明顯抑制PC12細胞和U87細胞中Fas的表達水平[15]，提示p38 MAPK可能是調控Fas表達的上游分子，而其是否參與調節羅哌卡因誘導的脊髓組織中Fas表達上調值得進一步探究。本課題組下一步將通過siRNA和p38 MAPK抑制劑干擾Fas/FasL通路進一步驗證Fas/Fasl在羅哌卡因誘導神經毒性中的具體作用。

綜上所述，本研究發現在鞘內注射羅哌卡因誘導大鼠神經損傷和脊髓背角細胞凋亡的過程中Fas/FasL的表達增加，提示Fas/FasL可能參與了羅哌卡因誘導的神經毒性，這為臨床預防和治療羅哌卡因引起的脊髓神經損傷提供理論基礎和實驗依據。