靶向抗腫瘤納米粒的制備及其增強聲動力/饑餓聯合治療效果評估

張 若 張 亮 黃 菊 楊 揚 王志剛

聲動力治療（sonodynamic therapy，SDT）是通過超聲激活聲敏劑產生具有細胞毒性的活性氧，從而殺傷腫瘤細胞［1］。與傳統的光動力治療（photodynamic therapy，PDT）相比，SDT可以避免能量穿過組織時發生的大幅衰減，具有更好的組織穿透性［2］。然而，缺乏腫瘤靶向性的聲敏劑限制了SDT的進一步應用［3］。IR780是常用的光敏劑，不僅具有良好的PDT效果，還是一種近紅外染料，可用于光聲成像，為腫瘤治療提供直觀的影像學信息［4］。研究［5］發現IR780在超聲輻照下可產生大量的活性氧，誘發腫瘤細胞的凋亡；同時，IR780可主動靶向腫瘤細胞，促使納米粒在腫瘤部位的聚集。因此，IR780作為聲敏劑用于SDT得到了廣泛的關注。但是，單獨應用SDT對腫瘤細胞的殺傷作用并不理想，與其他治療方法聯合使用可以達到更理想的治療效果［6］。葡萄糖氧化酶（GOx）是人體內固有的酶，可通過催化葡萄糖的降解、封鎖細胞的能量來源、抑制腫瘤細胞的生長與增殖，從而實現腫瘤的饑餓治療［7］。因此，本實驗以GOx為核心，嵌有IR780的聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）為外殼，擬制備一種核殼結構的多功能納米粒（IG@P納米粒），用以實現光聲成像、主動靶向腫瘤細胞及SDT/饑餓聯合治療。

材料與方法

一、主要實驗材料

鼠源性乳腺癌4T1細胞購于中國科學院細胞庫；PLGA（山東岱罡生物科技有限公司）；IR780、CCK8、GOx、鈣黃綠素（CAM）、碘化吡啶（PI）、聚乙烯醇（PVA）、DiI染料（美國Sigma公司）；DAPI染料、磷酸鹽緩沖液（PBS）、3，3，5，5，-四甲基聯苯胺（TMB）試劑盒（天津博士德生物科技有限公司）；雙骯、胰蛋白酶-EDTA（上海碧云天生物技術有限公司）；DMEM、10%胎牛血清（美國Gibco公司）；異丙醇溶液［重慶川東化工（集團）有限公司］。

二、主要實驗儀器

超聲波細胞破碎儀（VC105，美國Sonics公司）；馬爾文粒徑儀（ZS 90，美國Malvern公司）；紫外-可見光分光光度計（UV-23600，日本Shimadzu公司）；多功能酶標儀（SpectraMax M3，美國Bio-Rad公司）；掃描電鏡（Hitachi S-3400N，日本日立公司）；激光共聚焦顯微鏡（Hitachi 7600，日本Nikon公司）；光學顯微鏡（DP 70，加拿大Olympus公司）；光聲成像儀（Vevo LAZR，加拿大Visual Sonics公司）。

三、主要實驗方法

（一）納米粒的制備

1.IG@P、I@P、G@P、PBS@P納米粒的制備：稱取50 mg PLGA及2 mg IR780溶于3 ml二氯甲烷中；稱取10 mg GOx溶于200μl雙蒸水中。待上述試劑完全溶解后，將200μl含10 mg GOx的雙蒸水加入含PLGA及IR780的二氯甲烷溶液中，并采用超聲波細胞破碎儀進行第1次乳化（90 W，3 min）得到初乳；在初乳中加入10 ml PVA溶液，進行第2次乳化（60 W，2 min）得到終乳。將10 ml異丙醇溶液加入終乳中，并進行4 h的磁力攪拌，之后，將上述溶液進行離心洗滌（8000 r/min，5 min），反復進行3次，從而獲得IG@P納米粒。采用同樣的方法制備不含GOx的納米粒（I@P，200μl雙蒸水替代200μl含有10 mg GOx的雙蒸水）、不含IR780的納米粒（G@P，二氯甲烷溶液中不加IR780），以及僅含有PBS的納米粒（PBS@P，200μl PBS替代200μl含有10 mg GOx的雙蒸水且二氯甲烷溶液中不加IR780）。

2.DiI標記的納米粒的制備：在二氯甲烷溶液中加入10μl DiI染料，其余方法同上。

（二）理化性質檢測

1.采用光學顯微鏡及掃描電鏡觀察納米粒的形態。

2.采用馬爾文粒徑儀檢測IG@P納米粒的粒徑及電位。

3.采用紫外-可見光分光光度計分析IG@P納米粒及PBS@P納米粒的光學特性。

4.IG@P納米粒催化活性：參照TMB試劑盒說明書，采用多功能酶標儀檢測GOx在濃度2.5、5.0、10.0、20.0 mM葡萄糖溶液中的催化活性。

5.超聲作用下檢測IG@P納米粒產生活性氧能力：將3 ml 50μg/ml IG@P納米粒溶液與單線態氧熒光探針（50×10-6M）混合，并置于比色皿中，檢測超聲輻照0、15、30、45、60 s后溶液內活性氧產量。

（三）IG@P納米粒光聲成像

將制備好的IG@P納米粒（400μg/ml，200μl）加入凝膠模塊中，采用波長680～970 nm的激光輻照，采集光聲圖像并分析光聲信號強度，確定最佳激發波長。將不同濃度（100、200、300、400μg/ml）IG@P納米粒加入凝膠模塊中，用最佳激發波長的激光輻照，采集并分析光聲圖像及光聲信號值。

（四）IG@P納米粒對4T1細胞靶向性檢測

4T1細胞在DMEM完全培養基（10%胎牛血清，1%雙抗）中培養。將對數生長期的細胞采用胰蛋白酶-EDTA從培養瓶中消化下來，移至共聚焦皿中培養24 h后加入DiI標記的IG@P和G@P納米粒（60μg/ml，3 ml），分別孵育1、2、4 h后用多聚甲醛固定，并用DAPI染料進行細胞核染色。最后采用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞對納米粒的吞噬情況。

（五）IG@P納米粒的細胞毒性作用

1.CCK8法檢測納米粒的細胞毒性：將4T1細胞從培養瓶中消化下來，并移至96孔板中繼續孵育24 h。5個孔為1組，共分5組：對照組、饑餓治療組（G@P組）、靶向饑餓治療組（IG@P組）、聲動力治療組（I@P+US組）、聲動力/饑餓聯合治療組（IG@P+US組）。24 h后對照組加入200μl PBS，余組加入對應的納米粒（60μg/ml，200μl），并繼續孵育4 h。I@P+US組、IG@P+US組在孵育4 h后進行超聲輻照（2 W/cm2，30 s）并繼續孵育2 h。最后，每孔加入8μl CCK8染液，采用多功能酶標儀檢測450 nm處每孔的吸光度（OD值），并計算細胞存活率，公式為：細胞存活率=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。

2.CAM/PI雙染法檢測細胞毒性：為了更直觀地觀察納米粒對腫瘤細胞活性的影響，將消化下來的4T1細胞轉移至共聚焦培養皿中培養，同樣分為5組：對照組、G@P組、IG@P組、I@P+US組、IG@P+US組（方法同上），其中I@P+US組、IG@P+US組在孵育4 h后行超聲輻照（2 W/cm2，30 s）并繼續孵育2 h。最后，每個培養皿中加入10μl CAM/PI混合染料。30 min后采用PBS沖洗共聚焦培養皿，去除游離的納米粒及染料，加入DAPI染料繼續孵育15 min，于激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞的存活情況。

四、統計學處理

應用SPSS 20.0統計軟件，計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗或雙因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、IG@P納米粒理化性質

1.IG@P納米粒的基本性質：IG@P納米粒呈大小均一的球形（圖1A、B），平均粒徑為（248.1±24.3）nm（圖1C），平均電位為（-14.7±2.38）mV。紫外吸收光譜可見IG@P納米粒在783 nm處有明顯的吸收峰，而PBS@P納米粒無明顯吸收峰（圖1D）。

2.IG@P納米粒的催化活性：波長650 nm處可檢測到GOx催化葡萄糖分解產生的過氧化氫與TMB反應生成藍色物質；隨著葡萄糖濃度的增加，IG@P納米粒的催化速度增加。見圖1E。

3.IG@P納米粒的活性氧產量：在超聲輻照下IG@P納米?？僧a生大量的活性氧，且隨著輻照時間的延長，活性氧的產量逐漸增加。見圖1F。

二、IG@P納米粒體外光聲成像

IG@P納米粒在783 nm處有明顯吸收峰，見圖2A。在783 nm的激光輻照下，隨著IG@P納米粒濃度的增加（100、200、300、400μg/ml），光聲信號強度呈線性增強。見圖2B、C。

三、IG@P納米粒對4T1細胞靶向性

DiI標記的IG@P及G@P納米粒均呈紅色熒光，細胞核呈藍色熒光。激光共聚焦顯微鏡下觀示，隨著孵育時間的延長，DiI標記的IG@P納米粒在細胞內的聚集逐漸增多（圖3A）；而DiI標記的G@P納米粒在細胞內無明顯聚集（圖3B）。

四、IG@P納米粒的細胞毒性作用

1.CCK8法檢測納米粒的細胞毒性：對照組、G@P組、IG@P組、I@P+US組腫瘤細胞存活率分別為100%、（65.78±8.3）%、（47.4±9.9）%、（41.9±10.9）%，IG@P+US組腫瘤細胞存活率最低，僅（17.5±9.2）%，與其他各組比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）；IG@P組與G@P組、I@P+US組比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

圖1 IG@P納米粒的理化性質

圖2 IG@P納米粒體外光聲成像檢測

2.CAM/PI雙染法檢測細胞毒性：納米粒濃度為60μg/ml時，IG@P+US組細胞幾乎全部死亡（大片紅色熒光），而對照組細胞活性幾乎不受影響（大片綠色熒光）。見圖4。

討 論

圖3 孵育1、2、4 h后4T1細胞對DiI標記的IG@P納米粒（A）及G@P納米粒（B）吞噬情況的激光共聚焦顯微鏡下觀（×200）

SDT是一種新興的腫瘤治療方式，由超聲波激發聲敏劑后引發聲化學反應，產生具有細胞毒性的活性氧，從而引起腫瘤細胞的凋亡。聲敏劑在無超聲輻照時無細胞毒性，僅在超聲輻照下才在輻照區域產生具有細胞毒性的活性氧，對周邊正常組織損傷小，安全性高［3］。相較于傳統的放化療，SDT具有良好的時間及空間選擇性、無創性等優勢［1］。SDT主要包括兩個步驟，先是將聲敏劑遞送至腫瘤部位，隨后給予超聲輻照激發聲敏劑，產生聲動力效果［8］。但聲敏劑靶向性差，在腫瘤部位的富集效果差，限制了SDT的進一步應用。本實驗發現，IR780作為聲敏劑，可在超聲輻照的激發下產生大量的活性氧，隨著超聲輻照時間的延長，活性氧的產量增多。過量的活性氧增加了細胞內的氧化應激壓力，引起細胞的氧化損傷，從而殺傷腫瘤細胞。且IR780是脂溶性熒光小分子，可在不借助任何化學修飾的情況下靶向腫瘤細胞，增加腫瘤細胞對其的吞噬［4-5］。IR780靶向機制可能由于IR780為親脂性陽離子，通過靜電吸附作用與帶負電的腫瘤細胞膜相互作用，從而增加了納米粒在腫瘤內部的聚集［9］。本實驗4T1細胞靶向實驗表明，與未裝載IR780的納米粒（G@P納米粒）比較，IG@P納米?？蓪崿F在腫瘤細胞內的富集，證實IR780賦予了納米粒對腫瘤細胞的靶向性。IR780的主動靶向性通過增加載有聲敏劑的納米粒在細胞內的聚集，增加了超聲輻照下活性氧的產量，從而有望增效聲動力作用，進而增加對腫瘤細胞的殺傷作用。

圖4 CAM/PI雙染法檢測各組4T1細胞毒性的激光共聚焦顯微鏡下觀（×200）

研究［10］表明，聯合治療較單一治療效果更顯著。臨床上常用的輔助治療手段為化療，但是化療具有嚴重的副作用，限制其的進一步應用。大部分腫瘤細胞以葡萄糖為主要能量來源，用以維持其生長及增殖。GOx作為一種天然酶，可催化葡萄糖分解，具有良好的生物安全性，被用于腫瘤的饑餓治療。但GOx是非特異性催化葡萄糖分解，易導致正常組織內葡萄糖含量下降而損傷健康組織。本實驗通過細胞靶向實驗表明IR780的主動靶向作用，可促進納米粒在腫瘤細胞內特異性聚集，因此，GOx可以特異性地消耗腫瘤細胞內的葡萄糖，切斷腫瘤細胞的能量供應，從而抑制腫瘤的生長增殖而不損傷周圍正常細胞。本實驗使用PLGA為載體包載IR780及GOx用于乳腺癌的聯合治療，結果發現包載于納米粒內的IR780及GOx體外聲動力及催化效果未受到影響；隨后的細胞毒性實驗表明，靶向組（IG@P組）細胞存活率明顯低于非靶向組（G@P組），且聲動力治療與饑餓治療聯合應用（IG@P+US組）較單一治療（G@P組、I@P+US組）低，差異均有統計學意義（均P＜0.05），表明SDT與饑餓治療聯合應用具有更顯著的腫瘤細胞殺傷作用，IR780介導的腫瘤細胞靶向作用可增效抗腫瘤治療效果。

隨著納米醫療的不斷發展，診療一體化的納米探針受到越來越多的關注。光聲成像是近年來新興的診斷方法，可實時、無創、動態監測治療過程。其成像原理是在激光的激發下，分子將吸收的光能轉化成熱能，隨后引起組織的形態改變從而被超聲波探測，形成光聲圖像。光聲成像彌補了傳統光學成像組織穿透性差及超聲成像組織分辨率低的不足，將兩者優勢相結合，通過不同波長的光激發，實現對深部組織的高分辨成像［11］。本實驗中，IG@P納米粒在783 nm處光聲信號最明顯，且光聲信號隨著納米粒的濃度呈線性增強，表明IR780作為近紅外染料，具有良好的光聲成像效果，可以用于監測抗腫瘤治療效果。

綜上所述，本實驗成功制備了具有腫瘤靶向作用的IG@P多功能納米粒，可用于光聲成像，且可增效SDT/饑餓聯合治療，為腫瘤的治療提供了新的思路。但本實驗未能進一步在動物實驗中驗證，且IR780靶向腫瘤細胞的具體機制尚不完全明確，均有待后續實驗的進一步完善。