海芒果果實水提物及其原兒茶酸對米氏凱倫藻光合系統Ⅱ的影響

孫 東，陳 琪，朱 博，段美娜

（1.廣東海洋大學化學與環境學院，廣東 湛江 524088；2.暨南大學生命科學技術學院，廣東 廣州 510632；3.西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010）

有害藻華（harmful algal blooms,HABs）頻發于世界各地沿海，對水產養殖業、旅游業等造成嚴重的經濟損失，甚至威脅到海洋生態安全和人類健康，已經成為國際社會共同關注的重大海洋環境問題和生態災害[1-2]。據不完全統計，HABs 在全球范圍內每年可造成約80 億美元的經濟損失[3]。米氏凱倫藻（Karenia mikimotoi）是一種典型的有害甲藻，是一種常見的魚毒性赤潮藻，屬于甲藻門，裸甲藻目，凱倫藻屬，分布廣泛，常在太平洋沿岸[4]、印度洋和中國東南海暴發形成HABs[5]。我國東海從2002 年開始，幾乎每年暴發米氏凱倫藻藻華，造成魚類、貝類和其他海洋無脊椎動物的大量死亡[6]，已經嚴重威脅到近岸海洋生態系統的安全。

應對HABs 的措施大致分為兩類，即預防HABs 發生和在HABs 發生時進行控制。大量用于防治和控制赤潮發生的研究集中在物理、化學和生物學方法[7]。其中，海洋植物（藻類等）、沉水植物和紅樹植物的代謝產物（化感物質）等生物學方法具有污染程度小、容易降解、對近海海洋生態系統微生物群落干擾較小[7]等特點，為防治和控制HABs的發生提供新的方向[8]。

原兒茶酸（protocatechuic acid，PA）存在于多種紅樹植物中，海芒果（Cerbera manghas）中含有大量的PA[9-10]。PA 具有抗癌、抗衰老、抗病毒、抗菌，以及保護肝臟、腎臟的功能[11]，與其他酚酸類物質可以通過植被腐爛、植物根系分泌等方式釋放到海洋壞境中[12]。葉綠體是決定藻類光合能力的關鍵，其對環境脅迫最為敏感[13]。有研究發現，化感物質可以促進自由基和活性氧（reactive oxygen species,ROS）的生成，進而對藻細胞的細胞器產生損傷。當持續暴露或者化感物質濃度較高時，細胞無法清除自由基和活性氧，因此，藻細胞表現出氧化損壞或死亡的情況[14-15]。同時，多環芳烴和重金屬等污染物可破壞植物葉綠體，降低光合效率[16-17]，而光合能力的強烈抑制勢必會延緩藻類的生長和發育，達到抑制藻類生長的目的，進而控制赤潮發生。

為了探討紅樹植物及其主要抑藻物質對赤潮藻的抑制效應，以及對赤潮藻的光合系統PSⅡ的抑制機制，本研究開展了紅樹植物果實水提液及其主要抑藻物質對米氏凱倫藻生長、光合系統PSⅡ的抑制作用及機制研究，探尋不同濃度水提物和抑藻物質對赤潮藻光合作用的生理學差異，闡明紅樹植物及其主要抑藻物質對赤潮藻的生理學機制，以期為防治赤潮發生提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 赤潮藻的實驗室培養

實驗藻種米氏凱倫藻（Karenia mikimotoiGY-H36）購置于上海光語生物科技有限公司，保種于暨南大學生命科學技術學院。

藻種培養：接種于f/2 滅菌培養基中（表1），培養于人工氣候培養箱（新苗GZX-300BSH-Ⅲ，上海），其中海水配制采用人工海鹽（Dragon King，廣州）配制鹽度為 29±1。照度設置為 100 μmol·m-2·s-1，光暗周期比12 h∶12 h，溫度為（20±1）℃，每天輕輕搖晃并交換位置3 次。

1.2 海芒果果實水提物的制備

海芒果（C.manghas）果實采集于珠海市淇澳島紅樹林自然保護區。新鮮果實收集后，用蒸餾水洗凈，擦拭干凈，去果核，再經-80 ℃冷凍干燥（Wizard 2.0，Virtis，美國），用打粉機將凍干后的果實打成干粉備用。

稱量100 g 海芒果干粉加入到2 L 已滅菌的f/2培養基中。混合物封口后經70 ℃水浴加熱24 h，再超聲處理2 h，得到渾濁的褐色水提物。把該水提物經過濾紙過濾除渣，再經過孔徑0.22 μm 濾膜過濾以去除微生物，4 ℃下避光保存。母液濃度為50 g·L-1。

1.3 海芒果提取物抑藻率的計算

將海芒果果實水提物母液（50 g·L-1）按梯度稀釋至0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10 g·L-1，總體系為50 mL（表2）。米氏凱倫藻接種濃度為4.5×104L-1，每組設置3 個平行。每日取樣1 mL 用體積分數4%的甲醛固定進行細胞計數。計算抑制率IR，公式如下：

表2 海芒果提取物抑藻率實驗設計Table 2 Experimental design of algae inhibition

1.4 原兒茶酸母液的制備

購買原兒茶酸（TargetMol，美國，99.9%，CAS:99-50-3）標準品用于后續實驗。配置10 g·L-1的母液，按梯度稀釋至25、50、75、100、125 mg·L-1，總反應體積為50 mL。抑制率計算方法同1.3 節。

1.5 葉綠素快速熒光參數的測定

取2 mL 藻液于植物效率儀反應杯中，室溫下遮光暗適應20 min。采用手持式植物葉綠素快速熒光儀（Handy Plant Efficiency Analyzer,Handy PEA,Hansatech,英國）檢測葉綠素熒光動力學參數。

Handy PEA 使用過程：設置參數 3 000 μmol·m-2·s-1，增益為1.0×。用f/2 培養基將儀器調零后，將反應杯放入液體檢測器中，測定葉綠素熒光誘導動力學（OJIP）指標。通過分析得到OJIP曲線及相關光合系統Ⅱ電子傳遞相關參數。JIP-test相關參數和計算公式[19-20]見表3。

表3 JIP-test 相關參數和計算公式Table 3 Parameters and formulas of JIP-test

1.6 統計分析

所有實驗結果為3 組平行實驗分析所得，并采用平均值±SD 表示。組間差異顯著性分析采用One-way ANOVA 和LSD（SPSS statistics 25，IBM）進行統計分析，P＜ 0.05 為差異顯著。使用origin 8.5進行分析制圖。

2 結果與分析

2.1 海芒果果實水提物及其抑藻物質對米氏凱倫藻生長的影響

海芒果果實水提物可顯著抑制米氏凱倫藻的生長（圖1_A），且呈現出“低濃度促進、高濃度抑制”現象以及典型的“劑量-效應”關系，即低質量濃度（0.625 g·L-1）時促進藻類生長，當質量濃度逐漸升高時，抑制率顯著增加。圖1_B 顯示，在海芒果果實水提物質量濃度為5 g·L-1，暴露120 h時，對米氏凱倫藻的抑制率為（99.87±0.04）%，已經達到完全抑制的效果。原兒茶酸對米氏凱倫藻也有顯著的抑制效應（圖1_C），在暴露120 h 時，質量濃度為25、50 mg·L-1的原兒茶酸對米氏凱倫藻出現了顯著的抑制作用，但原兒茶酸質量濃度為25 mg·L-1時抑制率較低，為（17.82±2.58）%（圖1_D）。隨著質量濃度的升高，其抑制率逐漸增加，至75 mg·L-1時，已經出現了完全抑制效應。

圖1 海芒果果實水提物及其只要抑藻物質原兒茶酸對米氏凱倫藻的生長影響及120 h 抑制率Fig.1 Growth and 120 h inhibitory effects of fruit water extract and PA of Cerbera manghas L.on Karenia mikimotoi

2.2 海芒果果實水提物對米氏凱倫藻光合作用的影響

圖2 描述了海芒果果實水提物對米氏凱倫藻光合系統Ⅱ相對熒光值的影響。隨暴露時間的延長，米氏凱倫藻相對熒光值逐漸增加。在暴露48、72 h時，0.625、1.25 g·L-1的海芒果果實水提物對米氏凱倫藻的影響出現典型的“低濃度促進、高濃度抑制”的現象。10 g·L-1的海芒果果實水提物出現了最高抑制光合系統Ⅱ相對熒光產量的情況，在48 h時，其J-I-P相迅速下降；在120 h 時，熒光產量幾乎完全消失。

圖2 海芒果果實水提物對米氏凱倫藻葉綠素快速熒光動力學曲線的影響Fig.2 Rapid increase in fluorescence transients for Karenia mikimotoi exposed to fruit water extract for Cerbera manghas

為進一步了解海芒果果實水提液對米氏凱倫藻光合系統Ⅱ的影響，通過公式計算得到JIP-test相關數據進行分析，并得到以下結果（圖3）。反應中心密度指標RC/CS0在高質量濃度組（5、10 g·L-1）均顯著低于對照組，且隨質量濃度上升而下降。單位激發界面能量通量相關指標（ABS/CS0、DI0/CS0、ET0/CS0、TR0/CS0）在高質量濃度組，120 h 時均出現了不同程度的下降，且隨著質量濃度的上升而下降。與QA還原光合系統Ⅱ反應中心能量通量的數據顯示，120 h 時，TR0/RC 無顯著差異，高質量濃度處理組（5、10 g·L-1）的DI0/RC 和ABS/RC 均顯著低于對照組。熒光產量和通量比相關指標φP0、φE0和0ψ中，中高質量濃度組（2.5、5 g·L-1）φE0和0ψ出現上升的趨勢，而10 g·L-1的處理組則顯示出下降的現象；φP0則表現出隨著質量濃度增加，值也相對增加的情況。

圖3 海芒果果實水提物對米氏凱倫藻葉綠素a 熒光瞬時-JIP 參數的影響Fig.3 Effect of fruit water extract for Cerbera manghas on chlorophyll a fluorescence transient-JIP parameters in Karenia mikimotoi

2.3 原兒茶酸對米氏凱倫藻光合作用的影響

海芒果果實水提物中抑藻物質含量較多的原兒茶酸對米氏凱倫藻光合系統Ⅱ相對熒光值的影響（圖4）。隨著暴露時間延長，米氏凱倫藻的相對熒光值逐漸增加。原兒茶酸抑藻過程中并未出現海芒果果實水提物“低促高抑”現象。在24 h 時，125 g·L-1處理組中J-I-P 相迅速下降，且隨著時間延長而逐漸降低。其他各組均隨著質量濃度的升高，其相對熒光值出現了逐漸下降的趨勢。120 h 時，50 g·L-1的原兒茶酸就已經對米氏凱倫藻出現顯著的抑制情況。

圖4 原兒茶酸對米氏凱倫藻葉綠素快速熒光動力學曲線的影響Fig.4 Rapid increase in fluorescence transients for Karenia mikimotoi exposed to Protocatechuic acid

反應中心密度指標RC/CS0在中高質量濃度組（25～ 125 g·L-1）均顯著低于對照組（圖5_E），且隨質量濃度上升而下降，同時，25 g·L-1的RC/CS0略高于對照組。單位激發界面能量通量相關指標（ABS/CS0、DI0/CS0、ET0/CS0、TR0/CS0）在中高質量濃度組（25～ 125 g·L-1），24～ 120 h 時，均出現隨質量濃度的上升而下降現象（圖5_B-E）。與QA還原光合系統Ⅱ反應中心能量通量的數據顯示，120 h 時，高質量濃度組（125 g·L-1）TR0/RC 出現增加現象，其他各處理組均無顯著變化。高質量濃度組（125 g·L-1）的DI0/RC 和ABS/RC 均顯著高于對照組，其他組與對照組均無顯著變化。熒光產量和通量比指標中，φP0無顯著變化。中質量濃度組（50、75 g·L-1）φE0和0ψ出現上升趨勢，高質量濃度組（125 g·L-1）則顯示下降現象。

圖5 原兒茶酸對米氏凱倫藻葉綠素a 熒光瞬時-JIP 參數的影響Fig.5 Effect of Protocatechuic acid on chlorophyll a fluorescence transient-JIP parameters in Karenia mikimotoi

3 討論

本研究結果表明，海芒果果實提取物及其主要化感物質可顯著抑制常見赤潮藻米氏凱倫藻的生長，且能干擾米氏凱倫藻光合效能。相關研究也證實許多植物的組織、提取物、分泌物和代謝產物等可抑制藻類生長[21-23]。海芒果為一種半紅樹植物，我國東南沿海、南海北部沿岸均廣泛分布，其生態位與赤潮藻暴發時期的生態位部分重疊。因此，海芒果在赤潮防治中有獨特的研究空間和研究價值。

化感物質會影響藻類光合系統，甚至會影響到ATP 的合成[24]。本研究也發現，隨著濃度的逐漸升高，米氏凱倫藻的熒光動力學曲線J-I-P 相明顯下降，說明海芒果果實水提物和PA 均會抑制米氏凱倫藻的光系統PSⅡ的光活化。有研究發現，I-P 相降低是因為QB非還原中心比例增加導致的QA到QB的電子轉移受阻而引起的[25]。且隨著濃度的增加，F0、Fi、Fj和Fm均出現逐漸降低的情況，說明PSⅡ供體側的電子轉移受阻逐漸嚴重[26]。F0的逐漸降低可能是藻密度降低所引起的，然而O-I-J 相的降低可能是因為PSⅡ中天線復合體結構受損，同時抑制了PSⅠ的活性，進而導致電子轉移受阻[27-28]。這與本課題之前的研究結果相類似[19]，也與其他重金屬、多環芳烴、高溫等脅迫的研究結果相似[29-30]。因此，可推斷海芒果果實水提物和PA 與可能導致米氏凱倫藻光系統PSⅡ的供體和受體側結構和功能受損，天線復合體電子傳遞受阻有關。

中高質量濃度組ABS/CS0、DI0/CS0、ET0/CS0、TR0/CS0等參數的降低，表明水提液和PA 能夠抑制米氏凱倫藻光合系統對電子的吸收、電子傳遞；而DI0/RC 和ABS/RC 的增加，則表明了耗散和每反應中心吸收值的增加。筆者此前的研究發現，在96 h時，稀土元素鑭對微藻的DI0/RC 和ABS/RC 并無顯著變化[19]。有研究顯示，ABS/RC 的增加表明了反應中心失活，或者反應中心PSⅡ受到抑制或損傷[30]，而ABS/RC 的增加往往會導致DI0/RC 的增加，而DI0/RC 的增加進一步導致ROS 的產生，引起光合器的過氧化損傷[31]。因此，可推測高質量濃度組的DI0/RC 增加加速了ROS 的產生，引起了光合器的過氧化損傷加重；而中低質量濃度組DI0/RC 降低可以有效緩解脅迫帶來的過氧化損傷，這可能是米氏凱倫藻受脅迫后的一種自我調控保護機制。此外，PA 處理組中光合性能指數（Performance Index，PI）φE0和0ψ下降可能由光合系統中能量吸收、捕獲和電子轉移受阻引起[32]。

4 結論

本研究證明海芒果果實水提物及其主要物質原兒茶酸可以有效抑制米氏凱倫藻的生長。米氏凱倫藻受到脅迫后，其光合系統Ⅱ的反應中心密度、單位激發界面能量通量和QA還原光合系統反應中心均發生了變化，最終導致光合系統電子傳遞和電子吸收障礙，進而導致米氏凱倫藻生長受到抑制。這些結果表明海芒果及原兒茶酸可以作為一種有效防治赤潮發生的天然抑藻物質，以期為我國近海岸赤潮防治提供基礎數據。