山東銀蓮花組織培養(yǎng)植株再生體系的建立

陳春利， 顧德政， 劉 毓， 孟清秀， 李可勤

(1.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250100； 2.濟(jì)南市花卉研究所，山東濟(jì)南 250100)

山東銀蓮花[Anemoneshikokiana(Makino) Makino]是毛莨科(Ranunculaceae)銀蓮花屬(Anemone)植物朝鮮銀蓮花(Anemonechosenicola)的變種[1]，屬于多年生草本植物，特產(chǎn)于山東東部，以嶗山、昆崳山為分布中心，常生于海拔500 m以上的山坡草叢及陰濕林下，嶗山之嶗頂及昆崳山之泰礴頂附近草叢中常見(jiàn)其生長(zhǎng)[2]。海拔、生境等對(duì)其分布具有一定的影響，因此其分布極其狹窄，屬于典型的稀有物種，由于嶗山、昆崳山兩地均為旅游景區(qū)，山東銀蓮花的生境破壞嚴(yán)重，使得該物種更加稀有[3]。山東銀蓮花為我國(guó)的特有種質(zhì)資源，國(guó)外還未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道，而國(guó)內(nèi)目前對(duì)其報(bào)道也很少，最早可見(jiàn)的報(bào)道是臧得奎等在1999年對(duì)山東特有野生花卉進(jìn)行的初步研究[2]。2011年，徐曉艷等對(duì)山東銀蓮花種子萌發(fā)特性進(jìn)行了研究[4]。2014年，王鷙等對(duì)山東銀蓮花的分布格局及影響因子進(jìn)行了分析[1]，劉瓊從基因分化水平研究山東銀蓮花的遺傳多樣性[5]。關(guān)于山東銀蓮花引種馴化、組織培養(yǎng)、藥用價(jià)值的研究至今未見(jiàn)報(bào)道。為此，實(shí)現(xiàn)對(duì)山東銀蓮花的應(yīng)用，需要開(kāi)展相應(yīng)的人工栽培研究，而人工栽培的關(guān)鍵在于解決山東銀蓮花種苗繁殖問(wèn)題。本試驗(yàn)以山東銀蓮花幼嫩莖段為外植體，擬構(gòu)建穩(wěn)定的植株再生體系，并探討幾個(gè)相關(guān)影響因素，以期為山東銀蓮花的快速繁殖、遺傳多樣性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料的獲取

2015年10月于昆崳山泰礴頂，剪取山東銀蓮花帶飽滿頂芽的幼嫩莖段，用瓶裝水沖洗后裝入保溫杯內(nèi)。

1.2 材料消毒

取山東銀蓮花帶頂芽幼嫩莖段，用毛筆蘸洗衣粉水輕輕刷洗其表面灰塵，然后放入干凈的容器中，在流水下沖洗1～2 h，再用0.5%多菌靈粉劑浸泡15 min，隨后用蒸餾水沖洗 3～10次，最后用無(wú)菌吸水紙吸干外植體表面的水分。

外植體滅菌：將處理完的莖段轉(zhuǎn)移至三角瓶中，在超凈工作臺(tái)內(nèi)先用75%乙醇消毒30 s，之后用無(wú)菌水沖洗3次，然后用1% NaClO分別處理10、20、25 min，再用0.1% HgCl2分別處理8、10、13 min，在滅菌過(guò)程中滴加1～3滴吐溫并充分搖晃三角瓶，使殺菌劑與外植體充分接觸，最后用無(wú)菌水沖洗 6～10次，將長(zhǎng)為1～2 cm的莖段接種到含有0.2 mg/L 6-BA 的MS啟動(dòng)培養(yǎng)基中。每個(gè)培養(yǎng)瓶中接種1個(gè)外植體，每個(gè)處理接種30瓶，重復(fù)3次，7 d后觀察外植體的滅菌及生長(zhǎng)情況，并統(tǒng)計(jì)各處理間的污染率、褐化率、存活率。

1.3 繼代與增殖培養(yǎng)

以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-芐氨基腺嘌呤(即6-BA，濃度設(shè)為0.5、1.0、1.5 mg/L)、α-萘乙酸(即NAA，濃度設(shè)為0.00、0.05、0.20 mg/L)、赤霉酸(即GA3，濃度設(shè)為0.00、0.05、0.20 mg/L)作為愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。然后將消毒后的外植體接種于上述培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每個(gè)處理30株苗，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。

1.4 生根培養(yǎng)與移栽

取株高已達(dá)2 cm以上的叢生芽，在無(wú)激素的MS培養(yǎng)基中壯苗培養(yǎng)20 d，再接入1/2MS生根培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。生根培養(yǎng)基采用3因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素分別為NAA(濃度設(shè)為0.0、0.5、1.0 mg/L)、吲哚丁酸(即IBA，濃度設(shè)為0.0、5.0、10.0 mg/L)、蔗糖(濃度設(shè)為25、30、35 g/L)。每個(gè)處理30株苗，重復(fù)3次。

待組培苗生長(zhǎng)至10 cm左右時(shí)，開(kāi)蓋后煉苗1周，然后將完整的再生植株移栽于蛭石、珍珠巖、草炭體積比=1 ∶2 ∶2的基質(zhì)中(高壓滅菌)，并保持適宜溫度和濕度，隔天澆1次水。

1.5 培養(yǎng)條件

將培養(yǎng)室的溫度恒溫保持在(25±1) ℃，愈傷組織分化和植株再生階段的光照度為50 μmol/(m2·s)，光照時(shí)間為16 h/d。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用DPS 9.50、SPSS 18.0進(jìn)行方差分析和顯著性分析，用Excel 2003制表。觀測(cè)變量的計(jì)算公式如下：

增殖系數(shù)=新增殖的芽數(shù)/接種芽的總數(shù)；

污染率=(污染的外植體數(shù)/接種外植體的總數(shù))×100%；

褐化率=(褐化的外植體數(shù)/接種外植體的總數(shù))×100%；

存活率=(存活的外植體數(shù)/接種外植體的總數(shù))×100%；

生根率=(生根的組培苗數(shù)/接種組培苗的總數(shù))×100%；

誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)分化的外植體數(shù)/存活外植體的總數(shù))×100%；

移栽成活率=(移栽存活的組培苗數(shù)/移栽組培苗的總數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體滅菌方法的選擇

將經(jīng)過(guò)消毒處理的山東銀蓮花莖段接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，統(tǒng)計(jì)污染率、褐化率和存活率。由表1可以看出，用1% HgCl2消毒處理的外植體污染率極顯著低于1% NaClO處理，但褐化率極顯著高于1% NaClO處理。1% HgCl2處理10 min的外植體存活率最高，達(dá)到35.93%。1% HgCl2各處理間差異整體不顯著，但與1% NaClO處理10、20 min之間差異極顯著。通過(guò)上述多重比較，綜合分析不同消毒處理對(duì)外植體污染率、褐化率及存活率的影響可知，1% HgCl2處理 10 min 為適合山東銀蓮花莖段外植體的最佳消毒處理方法。

表1 不同消毒處理對(duì)山東銀蓮花莖段外植體污染率、褐化率及存活率的影響

2.2 增殖培養(yǎng)

將消毒好的外植體分別接種于添加不同種類和濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。由表2可知：6-BA、NAA、GA33種培養(yǎng)因素對(duì)山東銀蓮花組培苗增殖系數(shù)的影響程度差異很大，其中6-BA對(duì)增殖系數(shù)的影響最大，與其他處理間差異明顯。其次是GA3、NAA處理。對(duì)6-BA的各個(gè)水平間進(jìn)行多重比較發(fā)現(xiàn)，添加0.5、1.0 mg/L 6-BA與添加 1.5 mg/L 6-BA處理間存在極顯著差異，而添加0.5、1.0 mg/L 6-BA水平之間差異不顯著；添加GA3的組培苗與不添加的相比更加纖弱，苗不夠健壯，且有莖尖和葉片枯死現(xiàn)象。由此可見(jiàn)，最佳的增殖培養(yǎng)基為 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。

從試驗(yàn)觀察結(jié)果看，6-BA的濃度與山東銀蓮花的褐化程度密切相關(guān)，隨著濃度的增加，褐化程度加劇，當(dāng)6-BA的濃度達(dá)到1.5 mg/L時(shí)，更易導(dǎo)致組培苗的褐化，可能是由于6-BA能促進(jìn)酚類化合物的合成或者是刺激多酚氧化酶活性的提高。因此綜合分析確定MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+25 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂為山東銀蓮花的最佳增殖培養(yǎng)基，結(jié)果顯示，30 d時(shí)增殖系數(shù)為3.43。山東銀蓮花組培苗的增殖狀況見(jiàn)圖1、圖2。

2.3 生根與移栽

2.3.1 生根培養(yǎng)基的篩選 將經(jīng)過(guò)壯苗培養(yǎng)30 d、株高達(dá) 2 cm以上的健壯山東銀蓮花組培苗植株轉(zhuǎn)接入含有不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、蔗糖的培養(yǎng)基及基本培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。由表3可以看出：3種因素對(duì)山東銀蓮花組培苗生根率的影響程度差異很大，其中IBA對(duì)生根率的影響最大，其次是NAA和蔗糖處理，且IBA的各個(gè)水平間差異均達(dá)到了極顯著水平。因此可以得出，適合山東銀蓮花組培苗的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+10.0 mg/L IBA+35 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂。

表2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)山東銀蓮花組培苗增殖培養(yǎng)的影響

2.3.2 馴化移栽 移栽基質(zhì)的成分對(duì)組培苗的成活有很大影響，與組培苗能否移栽成活直接相關(guān)。由表4可知，在處理5培養(yǎng)基(珍珠巖、蛭石、草炭體積比=1 ∶2 ∶2)上生長(zhǎng)的組培苗較處理3、處理4 2種基質(zhì)成活率高，為83.36%，達(dá)到極顯著水平，而在處理2培養(yǎng)基(珍珠巖、蛭石、草炭體積比=0 ∶1 ∶1)上生長(zhǎng)的組培苗成活率最低。山東銀蓮花組培苗的最佳移栽基質(zhì)配比為珍珠巖、蛭石、草炭體積比=1 ∶2 ∶2。山東銀蓮花組培苗的生根與移栽狀況見(jiàn)圖3。

表3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及蔗糖對(duì)山東銀蓮花組培苗生根的影響

表4 不同比例的移栽基質(zhì)對(duì)山東銀蓮花組培苗移栽成活率的影響

3 討論

3.1 外植體的選擇及滅菌

選擇合適的外植體是植物組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素之一，一般在自然條件下生長(zhǎng)勢(shì)旺的植物種類更容易建立組培快繁體系，且易分化、增殖；而在自然條件下繁殖較慢的品種進(jìn)行離體培養(yǎng)的繁殖系數(shù)相對(duì)較小。山東銀蓮花是典型的山東省稀有植物物種，對(duì)生存環(huán)境的要求較為苛刻，在自然條件下生長(zhǎng)緩慢，抗逆性差，因而較難建立組培快繁體系。此外，山東銀蓮花組織培養(yǎng)中材料的大小選擇也十分重要，材料太大容易污染，材料太小，難以成活。因此，一般選取的材料長(zhǎng)度為0.5～1.0 cm左右。

山東銀蓮花的帶頂芽莖段由于直接暴露在土壤和空氣中，且有鱗片包被，其芽體和芽體內(nèi)部易積累污染物，因此消毒滅菌困難，只有選擇合適的滅菌劑和滅菌方法，才能有效建立起無(wú)菌體系，一般植物組織培養(yǎng)中常用的消毒劑有次氯酸鈉、次氯酸鈣、氯化汞等，在本試驗(yàn)中，HgCl2消毒的整體效果要遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于采用NaClO的消毒效果，但是山東銀蓮花外植體接種后會(huì)出現(xiàn)不同程度的褐化，隨著HgCl2濃度的提高，其褐化程度也在不斷加大，因而山東銀蓮花外植體的最佳滅菌方法是用75%乙醇消毒30 s，再用無(wú)菌水沖洗3次，然后用0.1% HgCl2處理10 min，最后用無(wú)菌水沖洗6次，接種后可獲得較低的污染率和最高的存活率。

3.2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)組培器官發(fā)生的影響

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)于培養(yǎng)物的生長(zhǎng)尤其是形態(tài)建成起著極其重要而明顯的作用，植物自身的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類和濃度調(diào)節(jié)著細(xì)胞分化、伸長(zhǎng)的啟動(dòng)，并調(diào)節(jié)愈傷組織生長(zhǎng)以及根、芽的分化和發(fā)育。但是外源激素必須通過(guò)植物體內(nèi)的內(nèi)源激素水平來(lái)起作用，因此，外植體形態(tài)發(fā)生的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)是通過(guò)多種激素的相互平衡以及協(xié)同來(lái)共同實(shí)現(xiàn)的。

6-BA是目前植物組培研究中常用的一種細(xì)胞分裂素，能夠有效誘導(dǎo)植物的分化再生，本研究表明，6-BA對(duì)組培苗增殖的影響極顯著，起到了決定性作用，6-BA和NAA配合使用可以獲得較高的增殖系數(shù)。試驗(yàn)觀察結(jié)果表明，6-BA 濃度與山東銀蓮花的褐化程度密切相關(guān)，隨著濃度增加，褐化程度加劇，當(dāng)6-BA濃度達(dá)到1.5 mg/L時(shí)，更易導(dǎo)致組培苗的褐化，原因可能是6-BA能促進(jìn)酚類化合物的合成或者是刺激多酚氧化酶活性的提高。一些植物在組培中添加GA3可促進(jìn)莖生長(zhǎng)、提高增殖系數(shù)，但有時(shí)會(huì)導(dǎo)致莖尖和葉片枯死，建議間斷使用。本研究添加一定濃度的NAA或GA3均取得了類似的效果。添加GA3的組培苗與不添加的相比更加纖弱，組培苗不夠健壯，且有莖尖和葉片枯死現(xiàn)象。因此，綜合分析確定MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+25 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂為山東銀蓮花的最佳增殖培養(yǎng)基。

3.3 生根培養(yǎng)

在生根培養(yǎng)過(guò)程中，大量的研究表明，起主導(dǎo)作用的是生長(zhǎng)素，不同類型的生長(zhǎng)素對(duì)組培苗的生根誘導(dǎo)差異比較明顯。本試驗(yàn)中植物激素的添加對(duì)山東銀蓮花組培苗生根率的影響程度差異很大，單獨(dú)添加IBA、NAA均能誘導(dǎo)山東銀蓮花組培苗不定根的產(chǎn)生，但添加IBA的生根效果明顯好于添加NAA的生根效果，添加NAA誘導(dǎo)出的根多為愈傷根系，而且分化出的根粗大，生長(zhǎng)異常，根系脆弱，一碰就斷，移栽時(shí)難以成活，組培苗經(jīng)過(guò)IBA誘導(dǎo)出的根系不經(jīng)過(guò)愈傷組織，從組培苗的基部直接發(fā)生，而且根系的生長(zhǎng)發(fā)育狀況好，根系健壯，從而移栽成活率高。因此在本試驗(yàn)中得出適合山東銀蓮花組培苗的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+10.0 mg/L IBA+35 g/L 蔗糖+6 g/L瓊脂。

4 結(jié)論

本研究以山東銀蓮花幼嫩莖段為外植體，分析了外植體消毒和不同激素配比對(duì)增殖、生根培養(yǎng)的影響，成功建立了其組織培養(yǎng)植株再生體系。結(jié)果表明，1% HgCl2處理10 min可以降低外植體污染率、褐化率，存活率較高；最佳增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+25 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂；最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+10.0 mg/L IBA+35 g/L 蔗糖+6 g/L瓊脂；最佳組培苗移栽基質(zhì)配比為珍珠巖、蛭石、草炭體積比為1 ∶2 ∶2。從外植體培養(yǎng)到植株再生共需16周左右。山東銀蓮花組培再生體系的建立為進(jìn)一步探討其遺傳多樣性奠定了基礎(chǔ)。