西紅花吸光度測定方法改進及其品質快速評價△

李慶，閆曉劍，黃永亮，彭善貴，趙小勤，周曉英，羅霄，文永盛

1.成都市食品藥品檢驗研究院，四川 成都 610045；2.國家藥品監督管理局 中藥材質量監測評價重點實驗室，四川 成都 610045；3.成都中醫藥大學，四川 成都 611137；4.成都虹微技術有限公司，四川 成都 610041

西紅花為鳶尾科植物番紅花CrocussativusL.的干燥柱頭?！吨腥A人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2005—2015年版西紅花檢查項下均有吸光度值測定方法[1-3]。筆者對存儲于成都市食品藥品檢驗研究院Laboratory Information Management System內近5年已發布的34份西紅花檢品和現有文獻中西紅花樣品按《中國藥典》方法測定吸光度值的數據合并統計[4-6]，發現86%的西紅花樣品吸光度值超出《中國藥典》2015年版規定的紫外分光光度法檢測的合理范圍(0.3～0.7)。同時，對本課題隨機采集的107份國產及伊朗產西紅花樣品采用該法測試，同樣發現有72%的樣品吸光度值不在0.3～0.7。《西紅花等級質量》[6]和《中國藥典》2015年版中均指明，西紅花含量測定應避光操作，而西紅花吸光度值測定法未對操作條件作規定。

當前標準或文獻中主要采用較為耗時的液相色譜法測定單個或數個有效成分作為西紅花主要質量控制指標[3，7-10]，但中藥功效是復雜成分協同作用的結果。西紅花吸光度值的測定波長為432 nm，該吸光度值與西紅花苷類成分含量呈正比。與單個或數個有效成分相比，吸光度值更能整體反映西紅花品質，同時紫外分光光度法測定速度快、成本低。因此，本研究對西紅花吸光度值測定方法進行了改進研究，并對不同產地、不同等級的西紅花品質進行比較和評價，為西紅花質量評價和控制方法的制定提供參考。

1 材料

1.1 試藥

收集伊朗及我國上海、浙江、河南、安徽產的西紅花樣品107份，其中伊朗70份，國產37份，見表1。樣品經成都市食品藥品檢驗研究院文永盛主任藥師鑒定為鳶尾科植物番紅花CrocussativusL.的干燥柱頭；對照品西紅花苷Ⅰ(批號：BP0406)、西紅花苷Ⅱ(批號：BP0407)購自成都普非德生物技術有限公司，純度均大于97.14%；甲醇為分析純。

表1 西紅花樣品信息

1.2 儀器

UV-2450型紫外分光光度計(日本島津公司)；SK250H型超聲儀(上?？茖С晝x器有限公司)。

2 方法

2.1 樣品制備

對所有西紅花樣品照《中國藥典》2015年版方法進行粉碎，備用。

2.2 提取方法考察

隨機選取上述粉碎好的西紅花樣品1份，精密稱取30 mg，分別考察索氏提取、回流提取、超聲提取對西紅花樣品吸光度值的影響。索氏提取法按照《中國藥典》2015年版中方法，提取至索氏管中液體無色為終點；回流提取法選取提取時間分別為30、45、60、75、90 min；超聲提取法選取提取時間分別為30、45、60、75、90 min。上述條件下所得提取液采用紫外-可見分光光度法在432 nm下測定吸光度值。

2.3 穩定性考察

以2.2項下超聲提取45 min的供試品溶液作為穩定性考察溶液，在10和25 ℃、避光與不避光條件下，每隔1 h測試，觀察吸光度值變化情況。

2.4 稀釋倍數的確定

按上述確定好的提取方法，考察所有粉碎好的西紅花樣品，精密稱取30 mg，置相應提取方法所需提取器中，按《中國藥典》2015年版西紅花吸光度值測定方法，測定所有西紅花樣品的吸光度值。根據吸光度值在一定范圍內與溶液質量濃度呈正相關關系，計算上述樣品的最適稀釋倍數。選擇在稀釋1000、1111、1250、1429、1667、2000倍條件下，所有西紅花樣品吸光度值在0.3～0.7數量最多的稀釋倍數。并按照計算的最適稀釋倍數測定樣品吸光度值。

2.5 對照品溶液配制和測定

精密稱取西紅花苷Ⅰ對照品5.591 mg、西紅花苷Ⅱ對照品4.201 mg，分別置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取3 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度為0.003 35 mg·mL-1的西紅花苷Ⅰ對照品溶液和質量濃度為0.002 52 mg·mL-1的西紅花苷Ⅱ對照品溶液，分別在波長270～650 nm進行掃描，獲取紫外光譜數據。

2.6 統計學方法

使用SAS軟件對測定結果進行正態性檢驗(Shapiro-Wilk normality test)、t檢驗(t-test)和秩和檢驗(Wilcoxon rank sum test)及變異系數(標準偏差與平均值的比值)計算。

3 結果與分析

3.1 西紅花樣品提取方法考察

不同提取方法提取后樣品的吸光度檢測結果見圖1。結果表明，回流提取的最佳效果不能達到索氏提取效果，而超聲45～75 min即可達到索氏提取效果，繼續增加超聲時間，則提取效果下降，表明超聲提取45 min可作為改進后的提取方法。

圖1 索氏提取、回流提取、超聲提取法提取西紅花效果比較(n=2)

3.2 西紅花樣品穩定性考察

由表2可知，在不避光條件下，西紅花樣品在25 ℃時2 h內吸光度值穩定(RSD<3%)，繼續增加放置時間吸光度值呈逐步下降趨勢；10 ℃時8 h內吸光度值穩定(RSD<3%)。在避光條件下，西紅花樣品在25 ℃時4 h內吸光度值穩定(RSD<3%)，10 ℃ 時8 h內吸光度值穩定。結果表明，在25 ℃、不避光條件下西紅花測定應盡快完成，而在25 ℃、避光條件下更加穩定。低溫條件下(10 ℃)無論是避光或不避光，8 h內測試液均表現出較好的穩定性。表明西紅花吸光度值應在避光條件下測定，并盡快完成測試。

表2 不同溫度、避光與否條件下西紅花樣品的穩定性比較(n=2)

3.3 西紅花樣品稀釋倍數考察

按《中國藥典》2015年版方法，選取稀釋倍數為1000，結果表明，僅28%的西紅花樣品吸光度值在0.3～0.7(圖2)。根據質量濃度與吸光度值呈正比，計算得出，當稀釋倍數為1667時所有西紅花樣品吸光度值在0.3～0.7的數量最多，即稀釋方法為樣品用40 mL甲醇提取后，加甲醇稀釋至100 mL，搖勻，再精密量取0.6 mL置于10 mL或精密量取3 mL置于50 mL量瓶中，搖勻，濾過，即得。按該稀釋倍數測定所有西紅花樣品的吸光度值，發現88%的西紅花樣品吸光度值在0.3～0.7(圖3)。

圖2 稀釋倍數為1000時西紅花樣品的吸光度值分布(n=2)

圖3 稀釋倍數為1667時西紅花樣品的吸光度值分布(n=2)

改進后的吸光度值測定方法稀釋倍數發生了改變，其限度也隨之變化，限度與代表性樣本的均值相關[11-13]，而吸光度值的大小與溶液的質量濃度在一定范圍內呈線性關系，因此，按照公式(1)計算新的吸光度限度值為0.3。

限度值=原吸光度限度×原吸光度限度下稀釋倍數/新吸光度限度下稀釋倍數

(1)

由圖3可知，107個樣品中21批樣品不合格，這與原吸光度限度為0.5時的判斷結果一致(圖2)。

3.4 樣品測定結果分析

按照優化后的方法測定107批西紅花樣品的吸光度，對所得光譜數據進行統計分析。國產的37份西紅花樣品的吸光度值為0.225～0.716，其中僅1批樣品不符合限度要求；伊朗產70份西紅花樣品的吸光度值為0.075～0.603，與國產樣品比較差異有統計學意義(P<0.001)，其中有20批不合格。同時，國產西紅花質量更加穩定(變異系數為0.206)，而伊朗產西紅花等級差別大，整體質量變異較大(變異系數為0.402)。樣品光譜圖見圖4A。結果表明，在本研究中，國產西紅花樣品質量優于伊朗產西紅花樣品，也與文獻報道相符[14]。目前，國產西紅花價格2～4萬元/kg，甚至更高，而伊朗產西紅花價格為1萬元/kg左右。

不同級別西紅花樣品吸光度值測定圖譜見圖4B。20份特級西紅花樣品的吸光度值為0.219～0.603，有2份不合格(合格率90%)；7份一級西紅花樣品的吸光度值為0.260～0.466，有5份合格(合格率71%)；12份二級及二級以下等級的西紅花樣品吸光度值為0.098～0.327，僅4份合格(合格率33%)。數據表明，特級西紅花合格率高于一級、二級和三級西紅花(P<0.05，P<0.001)，一級西紅花合格率高于二級和三級西紅花(P<0.01)。但筆者通過調查當前市銷西紅花等級劃分方法發現，商家主要根據貨物的狀態和自身經驗進行劃分，劃分標準比較混亂，如有的商家是根據花柱的長短、色澤進行劃分，有的則根據放置年限進行劃分，有的還根據雜質多少進行劃分等。圖4B中可以看出，特級西紅花、一級西紅花、二級西紅花之間的光譜線存在一定程度的交叉，因此有必要制定統一的和科學合理的等級劃分方法。

注：A.不同產地西紅花樣品；B.不同等級西紅花樣品；C.西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ。圖4 西紅花樣品、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的紫外光譜圖

由圖4C可知，西紅花甲醇提取液、西紅花苷Ⅰ甲醇溶液和西紅花苷Ⅱ甲醇溶液均在432 nm處有最大吸收峰，在457 nm處也均有1個較大吸收峰，西紅花苷類成分具有相同的母核，其主要差異是取代基糖數量和種類不同[15]。由于缺乏足夠的西紅花苷類成分對照品，由現有的西紅花苷Ⅰ和Ⅱ的吸收光譜可知，其他西紅花苷類如西紅花苷Ⅲ和Ⅳ等也應在432 nm處有最大紫外吸收。由于西紅花苷類成分是西紅花中的主要活性成分，該吸光度值的大小與單個或數個西紅花苷類成分含量的多少相比較，更能整體反映西紅花品質。

綜上，將《中國藥典》2015年版中西紅花吸光度測定方法中的索氏提取方法改為超聲提取45 min，同時將樣品稀釋倍數由1000倍增加到1667倍，并規定避光操作，其余過程按《中國藥典》2015年版方法操作，新的方法更加快速，所得結果更加科學合理。利用改進后的吸光度測定方法測定西紅花樣品，所得吸光度值可以準確評價不同產地、不同等級的西紅花質量。

4 討論

高效液相色譜法是當前中藥質量控制指標的主流測定方法，但該方法測定的指標有限，且測定過程耗時，成本較高。如對于西紅花藥材，《中國藥典》2015年版中采用高效液相色譜法同時測定西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的含量，兩者之和的限度為西紅花質量控制指標。已有文獻報道，國產西紅花樣品中西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ含量之和占西紅花總苷的80%，而進口西紅花為60%[16]，表明還有20%～40%的西紅花苷類成分沒有測定。增加中藥質量控制指標數是當前中藥質量控制的發展趨勢，但西紅花中除西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ外，其余西紅花苷類成分含量很低，并不適合采用高效液相色譜法測定，這在其他中藥中也較常見，如丹參中的丹參酮類成分、人參中的人參皂苷類成分、銀杏葉中的黃酮類成分，均僅能用液相色譜法測定幾個含量較高的成分。

紫外分光光度法測定速度快、成本低，在特定波長下，能夠同時對同類的多個組分快速完成測定，該測定值的大小可整體反映某類指標量的差異，進而評價中藥質量。

本研究利用紫外分光光度法所得吸光度值準確評價了不同產地、不同等級的西紅花質量，表明該測定方法可用于評價中藥的質量，是高效液相色譜法測定質量控制指標時的一個重要補充。另外，與常用的紫外分光光度法測定中藥中某類成分總的含量不同的是，本研究直接利用紫外分光光度法測定樣品溶液吸光度值即可，而不需要采用對照物質并制作標準曲線，進一步降低了測試難度和成本。改進后的西紅花吸光度值測定方法更加快速，所得結果更加科學、合理及準確，為西紅花藥材質量評價提供參考。