響應面法、BP神經網絡優化薏仁米酒產氨基酸態氮

鄒立飛，鄭鵬

（1.興義民族師范學院，貴州 興義 562400；2.云南師范大學，云南 昆明 650500；3.華南農業大學，廣東 廣州 510642）

薏苡是一種原產于亞洲，兼具食用和藥用價值的禾本科植物。2017年薏苡在我國貴州種植面積達到了4.67萬公頃，年產優質薏仁米約10.5萬噸，貴州薏仁米的主產區是貴州省黔西南州興仁市，同時興仁市也被譽為“中國薏仁米之鄉”[1]。薏仁米中含薏苡仁酯、神經酰胺、維生素E、蛋白質、類胡蘿卜素、核桃酚、多酚（針葉樹醇、丁香酸、阿魏酸、丁香酚等）、黃酮類化合物（芹菜素、木犀草素、諾皮素、陳皮素、異黃酮、槲皮素等）多種生物活性成分[2]，使得薏仁米在抗氧化、抗炎癥、抗癌、抗糖尿病、抗肥胖、調節腸道微生物群等上都有一定效果[3]。MANOSROIA等[4]通過研究薏仁米提取物對5種人體癌細胞的影響，結果發現薏仁米提取物對5種癌細胞都具有抗增殖能力。CHUNG C等[5]發現薏仁米乙醇提取物對胃癌細胞具有顯著的抑制作用，同時證實薏仁米中具有抗氧化活性的酚酸對潰瘍有緩解作用。CHOI G等[6]研究發現薏仁米水提取物作用于肥胖雄性小鼠可降低其脂肪積累和血清膽固醇水平，進而控制小鼠的體重。隨著消費者對綠色健康營養食品的需求，薏仁米及其相關食品越來越受到消費者的關注。國內薏仁米主要通過蒸煮的方式被食用，但簡單的蒸煮在一定程度上限制了薏仁米營養成分的吸收。通過對薏仁米進行加工處理使其有益生物活性成分更易被人體吸收變得很有必要。釀酒作為薏仁米加工的一個重要研究方向也得到消費者的認可。近年來，研究者對薏仁米酒進行了相關的研究。曹冠華等[7]通過正交試驗發現初始糖度0.2、初始pH 3、酵母量4%、薏仁∶冬瓜 1∶20（質量比）時，薏仁米酒感官體驗最佳。Xu L等[8]發現酵母發酵薏仁米后總酚量、氨基酸量顯著增加，同時增強了抗氧化能力、自由基清除活性。黃健等[9]通過響應面法分析得到物料比1∶2.6（質量比）、料液比 1∶2.9（g/mL）、接種量 2.5%、發酵時間 19 d 時，薏仁米酒香味和諧口感佳。現今薏仁米酒主要向保健酒方向發展，氨基酸作為酒中的主要營養物質，氨基酸量在一定程度上反映了酒的營養價值。并且氨基酸賦予酒濃香爽口、鮮美醇和的口感，同時其含量直接影響酒的整體風味和質量等級[10]。扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）是復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）的一個種，其可分泌產生β-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、生淀粉糖化酶、酸性蛋白酶等[11]；其中酸性蛋白酶在發酵工業中扮演著重要的角色，在酸性條件下水解蛋白質，釋放氨基酸或肽[12]。扣囊復膜酵母與釀酒酵母混合菌種相較于釀酒酵母單菌種發酵可以提高酒中氨基酸含量，增加酒的營養價值[13]。本研究將扣囊復膜酵母（S.fibuligera）A1、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）XY1混合之后用于薏仁米酒的釀造。同時在條件優化研究方面，傳統方法一般采用單因素試驗，即每次試驗只考慮一個因素，雖然單因素試驗具有試驗設計簡便、分析簡單等優點；但大多情況下是多因素同時影響，且各因素之間往往存在交互作用，這就導致單因素試驗得到的發酵條件很多情況下不為最佳發酵條件[14-15]。因此在條件優化時，不僅要考慮各因素單獨作用的效果，同時也需要考慮各因素之間交互作用的效果。響應面優化可以同時考慮各因素單獨作用和因素之間的交互作用，因此得到廣泛應用。但響應面法主要通過多元二次模型進行優化，對于其他類型的模型的擬合往往表現不佳。人工神經網絡（artificial neural network，ANN）最初是由 McCulloh和Pitts于1943年提出的，靈感來自于在神經系統中神經元的生物學特性[16]；多層前饋（back propagation，BP）神經網絡是人工神經網絡常用的一種，具有自學習、自適應、非線性映射等能力，能對任意復雜的非線性關系進行模擬[17]。

本研究將采用BP神經網絡耦合中心組合設計進行優化。薏仁米酒中氨基酸態氮為優化指標，薏仁米與糯米的質量比、混合菌種的接種量、溫度、水料比為影響因素，利用BP神經網絡對薏仁米酒發酵條件進行優化，以期為薏仁米酒優化尋找新的、更適合的優化方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

扣囊復膜酵母（S.fibuligera）A1、釀酒酵母（S.cerevisiae）XY1：興義民族師范學院生物與化學學院實驗室篩選獲得的菌株。

1.1.2 主要原料及試劑

薏仁米：貴州泛亞實業（集團）有限公司；散裝糯米：市售；淀粉酶（30 000 U/g）、糖化酶（50 000 U/g）：河南萬邦實業有限公司；酵母膏（生物試劑）、蛋白胨（生物試劑）、葡萄糖（生物試劑）、瓊脂（生物試劑）、甲醛（分析純）、氫氧化鈉（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.3 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）液體培養基：酵母膏10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L、pH值自然。YPD瓊脂培養基：酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L、pH值自然。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子液制備

挑取扣囊復膜酵母（S.fibuligera）A1、釀酒酵母（S.cerevisiae）XY1接種于不同的YPD瓊脂培養基上，均在30℃下培養48 h。從YPD瓊脂培養基上挑取單菌落轉接于不同YPD液體培養基中，均在30℃下培養48 h，將得到含A1菌株的液體與含XY1菌株的液體等體積混合即為種子液。

1.2.2 工藝流程

1.2.3 氨基酸態氮測定

氨基酸態氮測定采用甲醛滴定法[18]。

1.3 發酵條件優化設計

1.3.1 最陡爬坡試驗

在前期單因素試驗的基礎上，對水料比、薏仁米與糯米質量比、溫度、接種量設計合理的步長及變化方向，最終確定氨基酸態氮響應的最佳區間。

1.3.2 中心組合設計（central composite design，CCD）試驗

在最陡爬坡試驗結果的基礎上，將薏仁米∶糯米=2.0∶1（質量比）、接種量6.0%、溫度 30.0℃、水料比3.0∶1（mL/g）作為CCD的中心點，同時根據各因素對氨基酸態氮的影響確定各因素的其它水平，CCD試驗各因素水平設計見表1。同時應用Design Expert 11.0軟件對試驗進行設計。

表1 CCD試驗水平設計Table 1 Experimental level of central composite design

1.4 統計分析

1.4.1 響應面分析

應用Design Expert 11.0對中心組合試驗結果進行分析，得到一個多元二次模型。

式中：Y 為氨基酸態氮量，mg/L；i取 1～4；j取 2～4；n 取 4；Xi、Xj分別為不同因素；a0為常數項；aii、aij為對應自變量系數；ε為誤差項。

通過對該模型進行分析，最終得到最大氨基酸態氮含量的理論最優發酵條件及最優值。

1.4.2 BP神經網絡分析

BP神經網絡結構及模型擬合流程見圖1。

圖1 BP神經網絡結構及模型擬合流程Fig.1 The diagram of a typical BP neural network topology and the process of BP neural network fitting model

BP神經網絡是一種信號向前傳播、誤差逆向傳播的神經網絡。BP神經網絡結構是由輸入層、隱含層、輸出層構成，層與層之間全部相互連接，而同一層間不存在互連關系（圖1a）。BP神經網絡算法因具有易行、計算量小、簡單、并行性強等優點，在模型模擬仿真上得到廣泛的關注。其能通過不斷調整神經網絡的閾值和權值，使BP神經網絡輸出值與實際值的誤差不斷減小，進而改善其擬合效果，具體步驟流程見圖1b。

1.5 模型驗證及比較

通過對響應面模型、BP神經網絡模型分析，進而求得各自模型的理論最大氨基酸態氮及對應的最優發酵條件；在各模型最優發酵條件下對比試驗值與理論值是否一致，并計算相對誤差。同時通過比較響應面模型、BP神經網絡模型的相關系數（R）、決定系數（R2）、均方根誤差（root mean square error，RMSE）、絕對平均相對誤差（absolute average relative error，AARE）來確定更合適的模型。

2 結果與分析

2.1 最陡爬坡試驗結果

最陡爬坡試驗設計及結果見表2。通過對最陡爬坡試驗中各處理的氨基酸態氮含量的比較分析，確定CCD試驗的中心點。

表2 最陡爬坡試驗設計及結果Table 2 Experimental results and design of the steepest ascent path

由表2可知，處理1至處理3氨基酸態氮量逐漸增加，但處理3至處理5氨基酸態氮量逐漸減少，處理3條件下氨基酸態氮量最大，因此將處理3作為CCD試驗的中心點。同時將響應面優化大致范圍確定在處理2至處理4區間。

2.2 CCD試驗結果及響應面分析

在最陡爬坡試驗結果的基礎上，應用Design Expert 11.0軟件進行CCD試驗設計及試驗結果分析。CCD試驗設計及結果見表3。二次模型的方差分析見表4。

表3 CCD試驗設計及結果Table 3 Experimental results and design of the central composite design

表4 二次模型的方差分析Table 4 ANOVA for quadratic model

由表4可知，模型F值為34.37，相對應的P值小于0.000 1，說明此模型極顯著。同時，交互項X1X2差異顯著，一次項 X3、X4、交互項 X1X3、X1X4、X3X4、二次項X12、X22、X32、X42差異極顯著，且模型的 R2為 0.969 77，說明該模型較準確；并且模型的信噪比為21.425遠大于4，說明模型預測精確。通過二次模型方差分析得到模型：Y=-4 454.172 58+48.018 81X1+600.693 36X2+230.247 67X3-10.907 16X4-42.926 03X1X2+45.558 68 X1X3-228.097 94X1X4-4.098 53X2X3+30.483 8X2X4+49.43873X3X4-122.27793X12-39.21948X22-7.291 05X32-216.127 93X42。對該模型求解最優值可知：當薏仁米∶糯米=2.5∶1（質量比）、接種量為 5.7%、溫度為30.7℃、水料比為2.6∶1（mL/g）時，理論氨基酸態氮量達到842.1 mg/L。通過驗證試驗得到實際值為833.3 mg/L，與理論值相差不大。

響應面模型效果圖見圖2。

圖2 響應面模型效果圖Fig.2 The effect diagram of quadratic model

由圖2可知，在最優條件下，其響應面效果較好。綜上所述，通過響應面分析得到的模型具有較好的擬合效果及預測準確性。

2.3 BP神經網絡分析

在Matlab 2016a環境下，通過BP神經網絡對CCD試驗結果進行分析。BP神經網絡的主要參數：輸入層神經元個數為4，隱含層神經元個數為20，輸出層神經元個數為1，最大迭代次數為200；同時BP神經網絡的學習率為0.06。BP神經網絡模型均方誤差效果見圖3。

圖3 BP神經網絡模型均方誤差效果圖Fig.3 The effect diagram of mean square error of BP neural network model

由圖3可知，當迭代次數到3次時，BP神經網絡模型的驗證集均方誤差為0.008 271 1，且此時已經達到訓練結束的條件。

BP神經網絡模擬仿真效果見圖4。

圖4 BP神經網絡模擬仿真效果Fig.4 The simulation effect of the BP neural network

由圖4可知，BP神經網絡模型的相關系數達到了0.994 94，說明該模型擬合效果較好。通過對該模型進行最優值求解，發現在薏仁米∶糯米=2.8∶1（質量比）、接種量為4.8%、溫度為28.2℃、水料比為2.2∶1（mL/g）時，得到該模型的最大值，即為925.3 mg/L。同時對上述條件下得到的最優值進行驗證，最終得到實際值為918.7 mg/L，與理論值基本一致，說明其預測準確性較好。綜上所述，說明通過BP神經網絡得到的擬合效果及預測準確性均較好。

2.4 BP神經網絡與響應面模型比較

通過對BP神經網絡模型、響應面模型進行對比分析，確定較優的模型結果見表5。

表5 優化條件和驗證結果Table 5 Optimization conditions and validation

由表5可知，響應面模型、BP神經網絡模型在其各自模型最優條件下的理論值與試驗值的相對誤差都較小，但BP神經網絡模型的相對誤差更小。通過對兩種模型的相關系數（R）、決定系數（R2）、均方根誤差（root mean square error，RMSE）、絕對平均相對誤差（absolute average relative error，AARE）、線性擬合等進行分析，通過分析兩種模型的線性擬合效果及預測值與實際值的接近程度，確定在擬合效果上更優的模型，結果見表6、圖5及圖6。

表6 響應面法與BP神經網絡預測能力的比較Table 6 Comparison of predictive capacity of response surface methodology and BP neural network

圖5 響應面模型、BP神經網絡模型預測值與實際值線性擬合結果Fig.5 Linear fitting for predicted values（response surface methodology model and BP neural network model）with experimental values

圖6 響應面模型、BP神經網絡模型預測值與實際值比較結果Fig.6 Comparison of predicted values（response surface methodology model and BP neural network model）with experimental values

試驗結果顯示BP神經網絡模型相較于響應面模型的擬合效果更優。綜上說明BP神經網絡模型在本研究中擬合能力和優化能力更好。

ALRUGAIBAH M等[19]研究發現通過BP神經網絡優化蔓越莓果渣花青素的提取條件相較于響應面優化的準確度和精確度都更好。CHOUAIBI M等[20]通過研究響應面法和BP神經網絡對瓜蔞籽油產油率進行優化，試驗結果顯示BP神經網絡模型、響應面模型的決定系數（R2）、均方根誤差（RMSE）分別為 0.998、0.278 4和0.976 9、0.534 9，說明BP神經網絡比響應面具有更好的預測能力。GARG A等[21]采用BP神經網絡和響應面法優化海藻油生物柴油生產工藝，BP神經網絡、響應面法決定系數分別為0.99、0.96，說明BP神經網絡具有良好的可預測性。胡欣穎等[22]通過對比響應面法和BP神經網絡在優化松板肉工藝，試驗結果表明BP神經網絡優化后的成品率更好，誤差更小，擬合效果更好。

本研究也表明BP神經網絡在預測準確性、擬合效果上都要優于響應面法。綜上所述，BP神經網絡優化效果均好于響應面法，這可能是因為BP神經網絡可以通過誤差逆向傳播，使誤差不斷減小，進而預測值無限逼近真值，最終提高模型的擬合效果和預測能力[23-25]。本研究只針對氨基酸態氮量進行研究，但具體薏仁米酒中氨基酸的種類、各種氨基酸的含量及薏仁米酒中的其他有益物質含量有待進一步研究。

3 結論

本研究通過對比響應面、BP神經網絡在薏仁米酒中氨基酸態氮量的優化效果，最終發現BP神經網絡模型在擬合效果和預測準確性上都優于響應面模型。響應面優化的最佳發酵條件：薏仁米∶糯米=2.5∶1（質量比）、接種量為5.7%、溫度為30.7℃、水料比為2.6∶1（mL/g），此時氨基酸態氮的理論值為 842.1 mg/L，實際值為833.3 mg/L，預測值與實際值的相對誤差為1.0%；BP神經網絡優化的最佳發酵條件：薏仁米∶糯米=2.8∶1（質量比）、接種量為4.8%、溫度為28.2℃、水料比為2.2∶1（mL/g），此時氨基酸態氮的理論值為925.3 mg/L，實際值為918.7 mg/L，預測值與實際值的相對誤差為0.7%。響應面模型、BP神經網絡模型的相關系數（R）、決定系數（R2）、均方根誤差（RMSE）、絕對平均相對誤差（AARE）分別為 0.984 77、0.969 77、22.759 38、0.031 15 和 0.994 94、0.989 91、13.206 39、0.008 84。綜上所述，在本研究中BP神經網絡在預測準確性、擬合效果上都優于響應面，BP神經網絡對薏仁米酒氨基酸態氮優化效果更好。