荔枝木質(zhì)精油體外抑菌活性及穩(wěn)定性研究

董蕾，鄭玉璽，韓明，賈強(qiáng)

（廣州城市職業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與美食養(yǎng)生學(xué)院，廣東 廣州 510640）

植物精油（essential oils，EOs）分子量較小且具一定活性。已有大量研究發(fā)現(xiàn)，天然植物精油對(duì)常見致病菌均有優(yōu)異的抑制效果。如程鵬等[1]和陳和平等[2]均發(fā)現(xiàn)，薰衣草精油對(duì)單核細(xì)胞增多性李斯特菌、沙門氏菌等食物傳播性致病菌具很強(qiáng)的抗菌活性，TASSON等[3]發(fā)現(xiàn)薄荷精油對(duì)腸炎沙門氏菌和單核細(xì)胞擴(kuò)增李斯特菌具有抑制效果。隨后，研究者發(fā)現(xiàn)長豆角核[3]、丁香精油[4-5]、荔枝果核[6]、生姜、蒜、蔥、胡椒等香辛料[7]提取的多種精油均對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌、大腸埃希氏菌[8]等有優(yōu)異的殺菌、抗菌效果。

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是我國南方重要的經(jīng)濟(jì)樹種之一。以往對(duì)荔枝精油的研究，主要集中于荔枝果實(shí)[10-12]。而荔枝木每年經(jīng)輪植、修建所獲木材數(shù)量巨大，廢棄處理造成資源浪費(fèi)。在前期研究中，已成功利用蒸餾法提取荔枝木質(zhì)精油，并對(duì)荔枝木質(zhì)精油的成分進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）分析，發(fā)現(xiàn)烯類化合物為荔枝木質(zhì)精油中的主要揮發(fā)成分，占55.67%[13]。目前對(duì)荔枝精油特別是木質(zhì)精油的抑菌和抗氧化研究還未見報(bào)道。本研究對(duì)前期自行提取的荔枝木質(zhì)精油的抑菌抗菌性能及抗氧化性能進(jìn)行分析，為荔枝木質(zhì)精油的日化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 荔枝木質(zhì)精油

于2019年5月在廣東省高州市石鼓鎮(zhèn)采集約30年樹齡的妃子笑荔枝樹干，以韓明等[13]方法進(jìn)行荔枝木質(zhì)精油的提取。精油得率為0.71 mL/100 g。

1.1.2 供試菌種

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC6538、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC6633、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19115、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC14028：美國典型菌株保藏中心；腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）標(biāo)準(zhǔn)菌株 CMCC（B）50335、乙型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi β）標(biāo)準(zhǔn)菌株 CMCC（B）50094：中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心；黑曲霉（Aspergillus niger）FSCC114001、桔青霉（Penicillium chrysogenum）FSCC197001、黃曲霉（Aspergillus flavus）AS3.3554：廣東省微生物研究所。

1.1.3 主要試劑

營養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）、營養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；NaOH、檸檬酸（均為分析純）：南京化學(xué)試劑股份有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：美國Sigma公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備

LDZX-40AI立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；DH5000AB型電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津泰斯特儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化及菌懸液制備

細(xì)菌置于37℃24 h活化；霉菌置于28℃48 h活化。根據(jù)陳林林等[8]方法，在超凈工作臺(tái)上挑取適量活化細(xì)菌、霉菌到9 mL無菌水試管中，充分混合后，吸取1 mL混合菌懸液于另一支9 mL無菌水試管中，依次制備成梯度濃度的菌懸液。采用平板計(jì)數(shù)法（細(xì)菌）或顯微鏡直接計(jì)數(shù)法（霉菌）進(jìn)行計(jì)數(shù)，并根據(jù)結(jié)果將菌懸液濃度調(diào)至106CFU/mL～107CFU/mL。

1.2.2 抑菌活性研究

1.2.2.1 抑菌圈測(cè)定

以牛津杯法測(cè)定抑菌圈直徑[14]。吸取100 μL菌懸液均勻涂布于培養(yǎng)基表面（細(xì)菌為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、霉菌為PDA培養(yǎng)基），超凈工作臺(tái)上使用6 mm×10 mm無菌不銹鋼圓管在瓊脂上打孔，挑掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，并用瓊脂進(jìn)行封底。吸取100 μL荔枝木質(zhì)精油原液，加入打好的孔中，4℃下2 h預(yù)擴(kuò)散，而后30℃孵育24 h。DMSO為陰性對(duì)照。抑菌圈直徑的測(cè)定利用游標(biāo)卡尺，以十字交叉法進(jìn)行測(cè)量。每組進(jìn)行3次重復(fù)。

抑菌圈直徑>15 mm為最敏感、10 mm～15 mm為中度敏感、7 mm～9 mm為低度敏感，無抑菌圈為不敏感[15]。

1.2.2.2 最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）及最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）測(cè)定

MIC和MBC以氣相擴(kuò)散法[16-17]測(cè)定。將精油通過0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，吸取128 μL溶于1 mL DMSO中，制成128 μL/mL的精油溶液。在9 cm培養(yǎng)皿中分別加入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，將100 μL 106CFU/mL各菌懸液均勻涂抹至吸收。用移液槍吸取 0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 mL 精油溶液在皿蓋中央，使培養(yǎng)皿中精油含量為 1.25、2.5、5、10、20、40、80 μL/mL（9 cm 培養(yǎng)皿中體積約為 100 mL）。以不添加精油的培養(yǎng)皿為空白對(duì)照。快速密封培養(yǎng)皿，細(xì)菌于36℃培養(yǎng)20 h，霉菌于28℃培養(yǎng)5 d。以完全無菌生長的最小精油濃度為該菌的MIC。無菌條件下，將無菌生長的培養(yǎng)皿皿蓋替換成無精油添加的滅菌皿蓋，再繼續(xù)培養(yǎng)。以再次培養(yǎng)仍然無菌生長的精油濃度為該菌的MBC。

1.3 荔枝木質(zhì)精油穩(wěn)定性

1.3.1 不同pH值對(duì)荔枝木質(zhì)精油抑菌效果的影響

以2%NaOH和50%檸檬酸分別調(diào)節(jié)pH值達(dá)到4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 和 9.0，并以各 pH 值精油溶液進(jìn)行抑菌圈測(cè)定。

1.3.2 不同溫度對(duì)荔枝木質(zhì)精油抑菌效果的影響

將制備好的荔枝木質(zhì)精油原液分別置于40、60、80、100、120℃下進(jìn)行熱處理20 min，再冷卻至室溫（25℃），進(jìn)行抑菌圈測(cè)定。

1.3.3 紫外照射對(duì)荔枝木質(zhì)精油抑菌效果的影響

將荔枝木質(zhì)精油置于紫外燈（輻照強(qiáng)度70μW/cm2）下處理 10、20、30、40 min 后，進(jìn)行抑菌圈測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 荔枝木質(zhì)精油抑菌活性

荔枝木質(zhì)精油對(duì)不同細(xì)菌和霉菌的抑菌活性見表1。

表1 荔枝木質(zhì)精油對(duì)不同細(xì)菌和霉菌的抑菌活性Table 1 Antibacterial activity of Litchi chinensis wood oil against bacteria and fungi

如表1所示，抑菌圈與MIC測(cè)定結(jié)果均表明，荔枝木質(zhì)精油對(duì)枯草芽孢桿菌體外抑菌效果最優(yōu)，抑菌圈達(dá)到（16.94±0.44）mm，MIC 為 2.5 μL/mL，這可能是由于枯草芽孢桿菌在精油脅迫環(huán)境下迅速形成芽孢，進(jìn)入休眠狀態(tài)，形成較大抑菌圈。同時(shí)，荔枝木質(zhì)精油表現(xiàn)出對(duì)受試革蘭氏陽性菌的抑菌效果普遍優(yōu)于革蘭氏陰性菌，這可能是由于革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外側(cè)的脂多糖成分能夠阻止疏水化合物進(jìn)入微生物體內(nèi)，因此抑菌效果較差[18]。荔枝木質(zhì)精油對(duì)霉菌也具有較好的抑菌性，這可能是由于精油導(dǎo)致霉菌孢子形態(tài)結(jié)構(gòu)受損、破壞霉菌細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，影響了霉菌的正常生長[19]。

2.2 pH值對(duì)荔枝木質(zhì)精油抑菌效果的影響

不同pH值條件下荔枝木質(zhì)精油抑菌效果的影響見圖1。

圖1 不同pH值條件下荔枝木質(zhì)精油的抑菌效果Fig.1 Antibacterial activity of Litchi chinensis wood oil under different pH

如圖1所示，不同pH值對(duì)荔枝木質(zhì)精油的抑菌性能有顯著影響。受試菌在酸性荔枝木質(zhì)精油環(huán)境下的抑菌性能均有所提升。這可能是由于酸性條件本身抑制微生物生長，同時(shí)酸性環(huán)境也降低了精油中酚類化合物的酚羥基電離度，增加其疏水性，使精油更易與細(xì)菌細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)結(jié)合[20]，協(xié)同增強(qiáng)了荔枝木質(zhì)精油的抑菌性。

2.3 溫度對(duì)荔枝木質(zhì)精油抑菌效果的影響

溫度對(duì)荔枝木質(zhì)精油抑菌效果的影響見圖2。

圖2 不同熱處理?xiàng)l件下荔枝木質(zhì)精油的抑菌效果Fig.2 Antibacterial activity of Litchi chinensis wood oil under different temperature

如圖2所示，在荔枝木質(zhì)精油被加熱到60℃～80℃時(shí)，對(duì)受試細(xì)菌和霉菌有較好的抑菌效果，隨著加熱溫度提高，抑菌效果出現(xiàn)下降。這可能是由于精油中的揮發(fā)性抑菌成分受熱揮發(fā)，影響其抑菌效果。但在高于100℃時(shí)，荔枝木質(zhì)精油對(duì)受試細(xì)菌和霉菌均仍有較好抑菌效果。

2.4 紫外照射對(duì)荔枝木質(zhì)精油抑菌效果的影響

紫外照射處理不同時(shí)間后，荔枝木質(zhì)精油對(duì)受試細(xì)菌和霉菌的抑菌效果見圖3。

圖3 不同紫外照射時(shí)間下荔枝木質(zhì)精油的抑菌效果Fig.3 Antibacterial activity of Litchi chinensis wood oil under different ultraviolet ray irradiate time

如圖3所示，紫外照射處理對(duì)荔枝木質(zhì)精油的抑菌效果無太大影響，這表明荔枝木質(zhì)精油的紫外穩(wěn)定性較好，其抑菌成分不受紫外線影響，因此可應(yīng)用于食品的輻射保鮮中[21-22]。

3 結(jié)論

荔枝木質(zhì)精油對(duì)7種常見食源性致病菌和3種霉菌均具有良好的抑菌效果，其中對(duì)細(xì)菌的抑菌效果優(yōu)于霉菌；革蘭氏陽性菌的抑菌效果優(yōu)于革蘭氏陰性菌，尤其對(duì)鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌的MIC可以達(dá)到5 μL/mL。在穩(wěn)定性方面，荔枝木質(zhì)精油具有良好的紫外穩(wěn)定性；溫度和pH值對(duì)荔枝木質(zhì)精油的抑菌效果有影響。溫度低于100℃時(shí)，抑菌效果無顯著影響，高于100℃時(shí)，抑菌效果有所下降，但仍具有一定的抑菌效果；酸性條件增強(qiáng)了荔枝木質(zhì)精油精油的抑菌活性。