荔枝木質精油體外抑菌活性及穩定性研究

董蕾，鄭玉璽，韓明，賈強

（廣州城市職業學院食品科學與美食養生學院，廣東 廣州 510640）

植物精油（essential oils，EOs）分子量較小且具一定活性。已有大量研究發現，天然植物精油對常見致病菌均有優異的抑制效果。如程鵬等[1]和陳和平等[2]均發現，薰衣草精油對單核細胞增多性李斯特菌、沙門氏菌等食物傳播性致病菌具很強的抗菌活性，TASSON等[3]發現薄荷精油對腸炎沙門氏菌和單核細胞擴增李斯特菌具有抑制效果。隨后，研究者發現長豆角核[3]、丁香精油[4-5]、荔枝果核[6]、生姜、蒜、蔥、胡椒等香辛料[7]提取的多種精油均對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌、大腸埃希氏菌[8]等有優異的殺菌、抗菌效果。

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是我國南方重要的經濟樹種之一。以往對荔枝精油的研究，主要集中于荔枝果實[10-12]。而荔枝木每年經輪植、修建所獲木材數量巨大，廢棄處理造成資源浪費。在前期研究中，已成功利用蒸餾法提取荔枝木質精油，并對荔枝木質精油的成分進行氣相色譜-質譜聯用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）分析，發現烯類化合物為荔枝木質精油中的主要揮發成分，占55.67%[13]。目前對荔枝精油特別是木質精油的抑菌和抗氧化研究還未見報道。本研究對前期自行提取的荔枝木質精油的抑菌抗菌性能及抗氧化性能進行分析，為荔枝木質精油的日化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 荔枝木質精油

于2019年5月在廣東省高州市石鼓鎮采集約30年樹齡的妃子笑荔枝樹干，以韓明等[13]方法進行荔枝木質精油的提取。精油得率為0.71 mL/100 g。

1.1.2 供試菌種

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）標準菌株ATCC25922、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）標準菌株ATCC6538、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）標準菌株ATCC6633、單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）標準菌株ATCC19115、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）標準菌株 ATCC14028：美國典型菌株保藏中心；腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）標準菌株 CMCC（B）50335、乙型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi β）標準菌株 CMCC（B）50094：中國醫學細菌菌種保藏管理中心；黑曲霉（Aspergillus niger）FSCC114001、桔青霉（Penicillium chrysogenum）FSCC197001、黃曲霉（Aspergillus flavus）AS3.3554：廣東省微生物研究所。

1.1.3 主要試劑

營養瓊脂（nutrient agar，NA）、營養肉湯（nutrient broth，NB）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）：廣東環凱微生物科技有限公司；NaOH、檸檬酸（均為分析純）：南京化學試劑股份有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：美國Sigma公司。

1.1.4 儀器與設備

LDZX-40AI立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；DH5000AB型電熱恒溫培養箱：天津泰斯特儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化及菌懸液制備

細菌置于37℃24 h活化；霉菌置于28℃48 h活化。根據陳林林等[8]方法，在超凈工作臺上挑取適量活化細菌、霉菌到9 mL無菌水試管中，充分混合后，吸取1 mL混合菌懸液于另一支9 mL無菌水試管中，依次制備成梯度濃度的菌懸液。采用平板計數法（細菌）或顯微鏡直接計數法（霉菌）進行計數，并根據結果將菌懸液濃度調至106CFU/mL～107CFU/mL。

1.2.2 抑菌活性研究

1.2.2.1 抑菌圈測定

以牛津杯法測定抑菌圈直徑[14]。吸取100 μL菌懸液均勻涂布于培養基表面（細菌為營養瓊脂培養基、霉菌為PDA培養基），超凈工作臺上使用6 mm×10 mm無菌不銹鋼圓管在瓊脂上打孔，挑掉孔內培養基，并用瓊脂進行封底。吸取100 μL荔枝木質精油原液，加入打好的孔中，4℃下2 h預擴散，而后30℃孵育24 h。DMSO為陰性對照。抑菌圈直徑的測定利用游標卡尺，以十字交叉法進行測量。每組進行3次重復。

抑菌圈直徑>15 mm為最敏感、10 mm～15 mm為中度敏感、7 mm～9 mm為低度敏感，無抑菌圈為不敏感[15]。

1.2.2.2 最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）及最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）測定

MIC和MBC以氣相擴散法[16-17]測定。將精油通過0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，吸取128 μL溶于1 mL DMSO中，制成128 μL/mL的精油溶液。在9 cm培養皿中分別加入營養肉湯培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，將100 μL 106CFU/mL各菌懸液均勻涂抹至吸收。用移液槍吸取 0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 mL 精油溶液在皿蓋中央，使培養皿中精油含量為 1.25、2.5、5、10、20、40、80 μL/mL（9 cm 培養皿中體積約為 100 mL）。以不添加精油的培養皿為空白對照?？焖倜芊馀囵B皿，細菌于36℃培養20 h，霉菌于28℃培養5 d。以完全無菌生長的最小精油濃度為該菌的MIC。無菌條件下，將無菌生長的培養皿皿蓋替換成無精油添加的滅菌皿蓋，再繼續培養。以再次培養仍然無菌生長的精油濃度為該菌的MBC。

1.3 荔枝木質精油穩定性

1.3.1 不同pH值對荔枝木質精油抑菌效果的影響

以2%NaOH和50%檸檬酸分別調節pH值達到4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 和 9.0，并以各 pH 值精油溶液進行抑菌圈測定。

1.3.2 不同溫度對荔枝木質精油抑菌效果的影響

將制備好的荔枝木質精油原液分別置于40、60、80、100、120℃下進行熱處理20 min，再冷卻至室溫（25℃），進行抑菌圈測定。

1.3.3 紫外照射對荔枝木質精油抑菌效果的影響

將荔枝木質精油置于紫外燈（輻照強度70μW/cm2）下處理 10、20、30、40 min 后，進行抑菌圈測定。

2 結果與討論

2.1 荔枝木質精油抑菌活性

荔枝木質精油對不同細菌和霉菌的抑菌活性見表1。

表1 荔枝木質精油對不同細菌和霉菌的抑菌活性Table 1 Antibacterial activity of Litchi chinensis wood oil against bacteria and fungi

如表1所示，抑菌圈與MIC測定結果均表明，荔枝木質精油對枯草芽孢桿菌體外抑菌效果最優，抑菌圈達到（16.94±0.44）mm，MIC 為 2.5 μL/mL，這可能是由于枯草芽孢桿菌在精油脅迫環境下迅速形成芽孢，進入休眠狀態，形成較大抑菌圈。同時，荔枝木質精油表現出對受試革蘭氏陽性菌的抑菌效果普遍優于革蘭氏陰性菌，這可能是由于革蘭氏陰性菌細胞壁外側的脂多糖成分能夠阻止疏水化合物進入微生物體內，因此抑菌效果較差[18]。荔枝木質精油對霉菌也具有較好的抑菌性，這可能是由于精油導致霉菌孢子形態結構受損、破壞霉菌細胞膜和細胞壁，影響了霉菌的正常生長[19]。

2.2 pH值對荔枝木質精油抑菌效果的影響

不同pH值條件下荔枝木質精油抑菌效果的影響見圖1。

圖1 不同pH值條件下荔枝木質精油的抑菌效果Fig.1 Antibacterial activity of Litchi chinensis wood oil under different pH

如圖1所示，不同pH值對荔枝木質精油的抑菌性能有顯著影響。受試菌在酸性荔枝木質精油環境下的抑菌性能均有所提升。這可能是由于酸性條件本身抑制微生物生長，同時酸性環境也降低了精油中酚類化合物的酚羥基電離度，增加其疏水性，使精油更易與細菌細胞膜的蛋白質結合[20]，協同增強了荔枝木質精油的抑菌性。

2.3 溫度對荔枝木質精油抑菌效果的影響

溫度對荔枝木質精油抑菌效果的影響見圖2。

圖2 不同熱處理條件下荔枝木質精油的抑菌效果Fig.2 Antibacterial activity of Litchi chinensis wood oil under different temperature

如圖2所示，在荔枝木質精油被加熱到60℃～80℃時，對受試細菌和霉菌有較好的抑菌效果，隨著加熱溫度提高，抑菌效果出現下降。這可能是由于精油中的揮發性抑菌成分受熱揮發，影響其抑菌效果。但在高于100℃時，荔枝木質精油對受試細菌和霉菌均仍有較好抑菌效果。

2.4 紫外照射對荔枝木質精油抑菌效果的影響

紫外照射處理不同時間后，荔枝木質精油對受試細菌和霉菌的抑菌效果見圖3。

圖3 不同紫外照射時間下荔枝木質精油的抑菌效果Fig.3 Antibacterial activity of Litchi chinensis wood oil under different ultraviolet ray irradiate time

如圖3所示，紫外照射處理對荔枝木質精油的抑菌效果無太大影響，這表明荔枝木質精油的紫外穩定性較好，其抑菌成分不受紫外線影響，因此可應用于食品的輻射保鮮中[21-22]。

3 結論

荔枝木質精油對7種常見食源性致病菌和3種霉菌均具有良好的抑菌效果，其中對細菌的抑菌效果優于霉菌；革蘭氏陽性菌的抑菌效果優于革蘭氏陰性菌，尤其對鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特菌的MIC可以達到5 μL/mL。在穩定性方面，荔枝木質精油具有良好的紫外穩定性；溫度和pH值對荔枝木質精油的抑菌效果有影響。溫度低于100℃時，抑菌效果無顯著影響，高于100℃時，抑菌效果有所下降，但仍具有一定的抑菌效果；酸性條件增強了荔枝木質精油精油的抑菌活性。