河北省黑木耳主產區5種黑木耳的功能性成分及抗氧化性研究

馬欣欣，王晨，楊林英，楊嘉雪，張鐵軍，王謙*

（1.河北大學生命科學院，河北 保定 071000；2.承德市農業環境保護監測站，河北 承德 067000）

黑木耳（Auricularia auricula）又名光木耳，云耳，細木耳，隸屬于擔子菌門（Basidiomycota）、傘菌綱（Agaricomycetes）、木耳目（Auriculariales）、木耳科（Auriculariaceae）、木耳屬（Auricularia），是我國珍貴的食藥兼用菌類[1]。黑木耳具有很高的營養和藥用價值，不僅含有豐富的黑木耳多糖，還含有多酚和黃酮等功能性成分及 Ca、Mg、Fe、Mn 等微量元素[2-4]。有關研究表明，黑木耳具有抗凝血、提高人體免疫力、抗氧化和延緩衰老、降低血液膽固醇、抗菌作用等多種功能活性[5-9]。近年來，我國黑木耳產業發展迅速，已成為我國栽培量第二大的食用菌品種，據統計，2017年全國黑木耳產量達751.85萬噸，約占全國食用菌總產量的20.25%[10]。黑木耳栽培規模的快速提升帶來的初級產品的流通壓力，必然帶來其高附加值食品資源化開發利用的技術需求。

黑木耳中含有多糖、黃酮及多酚等多種抗氧化的活性成分，可調節細胞氧化還原狀態，抑制活性氧自由基，從而減少機體的損傷和疾病的發生。在黑木耳的特色食藥加工方面，徐田輝等[11]將木耳粉添加到曲奇制作過程中，通過控制配料的添加量，獲得了營養價值更高的風味曲奇餅干；何靜仁等[12]發明公開了一種含有黑木耳成分治療糖尿病及高血脂癥的藥品，可使用者擺脫使用化學藥物降糖所帶來的副作用；秦丹丹等[13]以黑木耳黑枸杞為原料研發出了一種復合飲料，并證明了復合飲料具有良好的抗氧化活性。本文對相同條件下培養的5個黑木耳品種的子實體進行部分功能性成分的相關檢測分析及抗氧化活性比較，為河北省黑木耳主產區品比研究及高附加值食品的開發利用提供了技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗所用樣品均來自河北省現代農業食用菌產業體系黑木耳產業企業試驗站-承德雙承生物有限公司。

5個黑木耳樣品分別為：黑威15、黑山、青灰小碗、黑厚圓、黑雜19。所用樣品均為相同栽培基質下的春耳。

試驗試劑均為國產分析純，試驗用水符合GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規格和試驗方法》規定的三級水；乙醇、蘆丁、硫酸、葡萄糖、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、沒食子酸、福林酚試劑：天津市永大化學試劑有限公司；碳酸鈉、2，2′-聯氨-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）[2，2′-hydrazine-bis（3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid），ABTS]、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）：北京索萊寶生物科技有限公司；鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、VC：福晨化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平（JJ224BC）：常熟市雙杰測試儀器廠；LD4-2高速離心機：鄭州博科儀器設備有限公司；渦旋振蕩器（WH-861）：常州市華怡儀器制造有限公司；恒溫振蕩器（DLHR-Q200）：北京東聯哈爾儀器制造有限公司；超聲清洗器（KH-5200B）：昆山禾創超聲儀器有限公司；722型分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；高速多功能粉碎機（Q-400B3D）：上海冰都電器有限公司；恒溫水浴鍋（HH-4）：金壇市杰瑞爾電器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱：上海飛躍實驗儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑木耳浸提物的制備

采摘新鮮的黑木耳樣品，在50℃恒溫干燥箱中烘干至恒重，然后在高速粉碎機中進行粉碎，過50目篩，將處理后的黑木耳粉放于干燥容器中備用[14]。

準確稱取3.000 g黑木耳粉放入250 mL錐形瓶中，按1∶25（g/mL）的料液比加入75%的乙醇溶液，在頻率40 kHz、功率200 W、溫度55℃的條件下超聲振蕩浸提30 min；過濾后將料液轉移至圓底燒瓶中，回流提取1 h；接著進行抽濾，先用提取劑潤洗抽濾瓶和布式漏斗，放置濾紙，將冷卻后的料液倒入，抽濾后定容，測定浸提液中粗多糖、黃酮及多酚含量。將上述剩余浸提液旋轉蒸發至干，得到黑木耳浸提物，將浸提物用75%的乙醇溶液配成不同的質量濃度，測定抗氧化活性。每組試驗重復3次。

1.3.2 粗多糖含量測定

黑木耳浸提液中粗多糖含量的測定采用苯酚硫酸法。參考文獻[15]制作葡萄糖標準曲線，以去蒸餾水為空白對照，于490 nm波長處測定吸光度，以葡萄糖含量（mg/mL）為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線圖，并求出標準曲線回歸方程Y=7.151 4X+0.005 8，回歸系數R2=0.999 2。精確量取1.0 mL樣品溶液，采用和標準曲線制作相同的方法計算樣品中粗多糖含量。

1.3.3 黃酮含量測定

黑木耳浸提液中黃酮含量的測定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法。參考文獻[16]制作蘆丁標準曲線，以無水乙醇為空白對照，于508 nm波長處測定吸光度，以蘆丁濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線圖，并求出標準曲線回歸方程Y=0.011 3X-0.011 7，回歸系數R2=0.998 9。精確量取1.0 mL樣品溶液，采用和標準曲線制作相同的方法計算樣品中黃酮含量。

1.3.4 多酚含量測定

黑木耳浸提液中多酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu比色法。參考文獻[17]制作沒食子酸標準曲線，以蒸餾水為空白對照，于490 nm波長處測定吸光度，以沒食子酸濃度（mg/mL）為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制沒食子酸標準曲線圖，并求出標準曲線回歸方程Y=0.108 4X+0.031 1，回歸系數R2=0.999 1。精確量取1.0 mL樣品溶液，采用和標準曲線制作相同的方法計算樣品中多酚含量。

1.3.5 ABTS+·清除率測定

將黑木耳浸提物配成不同質量濃度（1 mg/mL～6 mg/mL）的樣品溶液備用。配得ABTS儲備液：將7 mmol/L的ABTS與2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液等體積混合均勻；在使用前用無水乙醇將儲備液稀釋為在734 nm波長下吸光度2.00±0.10的ABTS工作液。取3 mL ABTS工作液與0.3 mL樣品溶液，室溫（25℃）下反應6 min，在波長734 nm處測得吸光度為Ax[18-19]；每個濃度平行試驗3次，取平均值，根據公式（1）計算黑木耳不同質量濃度浸提物對ABTS+·的清除率。

式中：Ax為樣品溶液中加入各工作液的吸光度；A0為蒸餾水代替樣品溶液的吸光度；Ax0為蒸餾水代替ABTS工作液的吸光度。

1.3.6 DPPH·清除率測定

參考Zhou等[20]的方法稍作修改，將黑木耳浸提物配成1 mg/mL～8 mg/mL的樣品溶液備用，分別取2 mL樣品溶液放于具塞試管中，各加入2 mL 100 μmol/L DPPH工作液，放于25℃恒溫箱中避光培養30 min，在波長517 nm處測得吸光度為Ay，每個濃度平行試驗3次，取平均值，根據公式（2）計算黑木耳不同質量濃度浸提物對DPPH·的清除率。

式中：Ay為樣品溶液中加入各工作液的吸光度；A0為無水乙醇代替樣品溶液的吸光度；Ay0為無水乙醇代替DPPH工作液的吸光度。

1.3.7 還原力檢測

參考邱軍強等[21]的方法稍作修改，將黑木耳浸提物配成不同質量濃度（2 mg/mL～10 mg/mL）樣品溶液，取1 mL的樣品溶液與1 mL磷酸緩沖溶液（0.2 mol/L，pH6.6）和 1 mL 1%鐵氰化鉀 K3Fe（CN）6溶液混合均勻，在50℃條件下孵化20 min，冷卻后加入2 mL 10%的三氯乙酸溶液，振蕩混勻，取2 mL的混合液和0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，靜置10 min后迅速在波長700 nm處測得吸光度為Az，每個濃度平行試驗3次，取平均值，根據公式（3）計算黑木耳不同質量濃度浸提物的相對還原能力。

式中：Az為樣品溶液中加入各工作液的吸光度；A0為蒸餾水代替樣品溶液的吸光度；AVC為VC溶液（0.25 mg/mL）代替樣品溶液的吸光度。

1.3.8 數據統計與分析

采用SPSS 19.0軟件中Duncan式新復極差法，進行差異顯著性分析；采用origin9進行數據處理繪制折線圖。

2 結果與分析

2.1 黑木耳功能性成分

2.1.1 子實體粗多糖含量對比結果

黑木耳子實體粗多糖含量對比結果見表1。

表1 黑木耳子實體粗多糖含量對比結果Table 1 Comparison of crude polysaccharide content in fruit body of Auricularia auricula

由表1可知，不同黑木耳品種中粗多糖含量不同。在5種黑木耳子實體中，粗多糖介于7.52 g/100 g至10.39 g/100 g，其中黑厚圓粗多糖含量最高達到10.39 g/100 g，與其它4個黑木耳品種中粗多糖含量產生了極顯著性差異（P<0.01），青灰小碗與黑山中粗多糖含量差異不顯著（P>0.05），黑山與黑雜19之間差異也不顯著（P>0.05），其它4個黑木耳品種的黑威15中粗多糖含量相對較少為（7.52±0.26）g/100 g。

2.1.2 子實體黃酮含量對比結果

黑木耳子實體黃酮含量對比結果見表2。

表2 黑木耳子實體黃酮含量對比結果Table 2 Comparative results of flavonoids content in fruit body of Auricularia auricula

由表2可知，不同黑木耳品種中黃酮含量存在差異。在5種黑木耳子實體中，黃酮含量介于3.61mg/100 g至5.92 mg/100 g，其中黑山黃酮含量最高為5.92 mg/100 g，與其他4個黑木耳品種產生了極顯著性差異（P<0.01），其它4個黑木耳品種的黃酮含量由多到少依次為青灰小碗、黑厚圓、黑威15、黑雜19，分別為5.08、4.68、4.26、3.61 mg/100 g。

2.1.3 子實體多酚含量對比結果

黑木耳子實體多酚含量對比結果見表3。

表3 黑木耳子實體多酚含量對比結果Table 3 Comparison of polyphenol content in fruit body of Auricularia auricula

由表3可知，不同黑木耳品種多酚含量存在一定差異，黑威15與其它4個品種多酚含量出現極顯著性差異（P<0.01），黑山和青灰小碗多酚含量差異不顯著（P>0.05），黑厚圓和黑雜19多酚含量差異也不顯著（P>0.05）。5種黑木耳子實體多酚含量介于1 025.59 mg/100 g至1 309.87 mg/100 g，黑威15多酚含量最多為1 309.87 mg/100 g，其它4個黑木耳品種的多酚含量由多到少依次為黑山、青灰小碗、黑厚圓、黑雜 19，分別為 1 132.90、1 103.08、1 042.37、1 025.59 mg/100 g。

2.2 黑木耳抗氧化活性

2.2.1 ABTS+·清除率

黑木耳子實體浸提物對ABTS+·的清除率見圖1。

圖1 黑木耳子實體浸提物對ABTS+·的清除率Fig.1 Scavenging rate of extracts from Auricularia auricula fruit body on ABTS cation free radical

ABTS+·是由過硫酸鉀氧化ABTS+產生的一種自由基，當體系中存在氫供體的抗氧化劑時，ABTS+·就會因為發生還原反應而褪色。由圖1可知，不同品種黑木耳浸提物的濃度與ABTS+·清除率存在著量效關系，在樣品溶液的質量濃度為0～6 mg/mL范圍內，5種黑木耳子實體浸提物對ABTS+·的清除率隨著樣品質量濃度的增加逐漸提高。在樣品質量濃度為6 mg/mL時，黑山對ABTS+·的清除率為最大即85%，黑雜19對ABTS+·的清除率最小為70%。采用半數抑制率（IC50）定義為清除自由基達50%時的樣品濃度，5種黑木耳子實體浸提物對ABTS+·的清除能力的IC50大小依次為：黑山（IC50=2.246 mg/mL）<黑威 15（IC50=2.509 mg/mL）<青灰小碗（IC50=2.988 mg/mL）<黑厚圓（IC50=3.148 mg/mL）<黑雜 19（IC50=3.524 mg/mL）。

2.2.2 DPPH·清除率

黑木耳子實體浸提物對DPPH·的清除率見圖2。

圖2 黑木耳子實體浸提物對DPPH·的清除率Fig.2 DPPH·free radical scavenging rate of extracts from Auricularia auricula fruit body

DPPH·在有機溶劑中可穩定存在，溶于乙醇溶液后呈紫紅色，且在517 nm處有最大吸收，當體系中的抗氧化劑與DPPH·反應時，顏色變淺，逐漸變為淡黃色，吸光度也逐漸減小，可通過測定溶液的吸光度來判斷其清除自由基的效果。由圖2可知，在樣品溶液的質量濃度為0～7 mg/mL范圍內，隨著質量濃度的增加，樣品對DPPH·的清除率也逐漸提高，并呈現一定的劑量效應。當質量濃度達到7 mg/mL之后，樣品對DPPH·的清除率增加緩慢。在樣品質量濃度為8 mg/mL時，黑山對DPPH·的清除率達由大到小依次為黑山>黑威15>青灰小碗>黑厚圓>黑雜19。5種黑木耳子實體浸提物對DPPH·的清除能力的IC50大小依次為：黑山（IC50=4.693 mg/mL）<黑威 15（IC50=4.992 mg/mL）<青灰小碗（IC50=5.389 mg/mL）<黑厚圓（IC50=5.694 mg/mL）<黑雜 19（IC50=5.882 mg/mL）。

2.2.3 還原力

黑木耳子實體浸提物的還原力見圖3。

圖3 黑木耳子實體浸提物的還原力Fig.3 Reducing power of extracts from Auricularia auricula fruit body

還原能力的測定是根據鐵氰化鉀與抗氧化物質反應，生成亞鐵氰化鉀，再加入三價鐵離子與亞鐵氰化鉀反應，生成的藍色物質在700 nm處有較強的吸收，吸光度越大，樣品還原能力越強。由圖3可知，在質量濃度0～8 mg/mL范圍內，5種黑木耳子實體的還原力隨著浸提物質量濃度的增加而增加，當濃度超過8 mg/mL時，還原力隨著濃度的進一步增大變化趨勢變小。當樣品質量濃度為10 mg/mL時，5種黑木耳子實體浸提物還原力最強的是黑山達到88%，其次是黑威15還原力為80%，黑雜19還原力相對較低為72%。

3 結論

結果表明，在河北省主產區相同環境條件下栽培的5種黑木耳子實體粗多糖、黃酮、多酚含量及抗氧化活性存在一定差異。5個黑木耳品種子實體中粗多糖含量7.52 g/100 g～10.39 g/100 g，黃酮含量3.61 mg/100 g～5.92 mg/100 g，多酚含量 1 025.59 mg/100 g～1 309.87mg/100g。粗多糖含量最高的品種為黑厚圓，黃酮含量最高的品種為黑山，多酚含量最高的品種是黑威15，表現出生物多樣性中種水平上生物活性物質含量的多樣性。5個黑木耳品種子實體浸提物均具有有效的自由基清除能力和還原力，黑山的抗氧化性表現最強，其次為黑威15、青灰小碗、黑厚圓、黑雜19。黑木耳子實體浸提物中還含有除粗多糖、黃酮及多酚以外的有關抗氧化成分的活性物質，在以后的試驗中應繼續深入研究。該項研究也為本崗位團隊負責的河北省黑木耳產業體系工作提供了技術支撐，同時，對河北省黑木耳高附加值食品的技術創新具有現實意義。