丙溴磷對映異構(gòu)體在柑橘中的殘留分析及選擇性降解

董 超, 李 晶, 楊 秦, 張耀海, 趙其陽, 焦必寧

(西南大學(xué) 柑桔研究所，重慶 400712)

在中國生產(chǎn)銷售的化學(xué)農(nóng)藥中，手性農(nóng)藥所占比例接近40%，且這一比例隨著新化合物的不斷研發(fā)仍在持續(xù)增加[1]。手性農(nóng)藥不同對映異構(gòu)體的活性、毒性及其在生物體和環(huán)境中的降解存在顯著差異[2-3]，而目前考察手性農(nóng)藥對人類健康和環(huán)境安全的影響時，通常沒有區(qū)分對映異構(gòu)體差別，導(dǎo)致手性農(nóng)藥風(fēng)險評估不夠準(zhǔn)確和全面，進(jìn)而給人類和環(huán)境帶來諸多隱患[4]。為此，從對映體水平建立手性農(nóng)藥殘留分析方法，研究其在作物及環(huán)境中的選擇性降解行為規(guī)律，是對傳統(tǒng)農(nóng)藥殘留研究方法的重要補(bǔ)充。

丙溴磷 (profenofos) 是由汽巴-嘉基公司開發(fā)的高活性有機(jī)磷殺蟲劑[5]，因其對柑橘紅蜘蛛具有良好的防治效果而在柑橘產(chǎn)業(yè)中廣泛使用，但其在柑橘中降解緩慢，殘留檢出率較高，給柑橘水果的食用安全和產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展造成了較為嚴(yán)重的威脅[6]。而丙溴磷屬于手性農(nóng)藥，存在一對對映異構(gòu)體 (圖式1)。

目前，丙溴磷仍以外消旋體形式生產(chǎn)、銷售及使用，有關(guān)其在柑橘等水果中的殘留降解研究已有較多報道[7-9]，但均集中于外消旋體水平。有研究表明：(?)-丙溴磷對于大型蚤Daphnia magna24 h的急性毒性顯著大于 (+)-丙溴磷 (EC50分別為0.67和4.38 μg/L)[10]；(?)-丙溴磷對家蠅的毒殺活性也顯著高于其對映體 (LD50分別為6 μg/g和23 μg/g)[11]；丙溴磷對映體在土壤中存在選擇性降解，其中 (+)-丙溴磷在天津堿性黃土和武漢堿性紅土中的降解速率快于 (?)-丙溴磷[12]。因此，有必要從對映體角度研究丙溴磷的環(huán)境行為。

鑒于此，本文以丙溴磷為研究對象，在反相模式下優(yōu)化其對映體分離條件，確定其出峰順序，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù) (HPLC-MS/MS)，建立了丙溴磷對映體在柑橘中的殘留分析方法；進(jìn)一步通過田間試驗，考察并比較了其在柑橘中選擇性降解行為的差異。旨在為系統(tǒng)開展手性農(nóng)藥丙溴磷在柑橘上降解的立體選擇性行為研究提供數(shù)據(jù)支持，也為全面開展其在柑橘上降解安全評價研究提供參考方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Shimadzu LC-30AD HPLC+AB Qtrap 6500液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測儀 (美國AB SCIEX公司)；Sigma3-15K臺式冷凍離心機(jī) (德國Sigma公司)；CK2000高通量組織研磨儀 (北京托摩根公司)。手性柱Lux Cellulose-1、Lux Amylose-2、Lux Cellulose-3及Lux Cellulose-4購自美國菲羅門公司，手性柱ND(2)-RH、NS(2)-RH及NZ(2)-RH購自廣州菲羅門公司，具體參數(shù)見表1。

表1 七種商品化的多糖類手性固定相色譜柱Table 1 Seven different kinds of chiral column of polysaccharide-based chiral stationary phases

丙溴磷外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品 (純度99.9%，德國Dr公司)；甲醇和乙腈 (色譜純，德國Sigma-Aldrich公司)；乙二胺-N-丙基硅烷 (PSA) 和石墨化炭黑(GCB)(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；4種不同內(nèi)徑規(guī)格的多壁碳納米管 (內(nèi)徑為8～10 nm、10～20 nm、20～30 nm和30～50 nm) (中國科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)公司)；有機(jī)相針式過濾器 (0.22 μm，上海安譜科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 殘留分析方法

1.2.1 檢測條件

色譜條件：采用手性柱ND(2)-RH，柱溫35 ℃，流動相V(甲醇) :V(水) = 70 : 30，采用等度洗脫模式，流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量2 μL。在該條件下，(+)-丙溴磷和 (?)-丙溴磷的保留時間分別為19.49和22.00 min。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子 (ESI) 源，正離子模式。氣簾氣 (CUR) 137.9 kPa，碰撞器 (CAD)Medium，離子化電壓 (IS) 5 500 V，離子源溫度500 ℃，噴霧器 (GS1) 344.7 kPa，輔助加熱器 (GS2)344.7 kPa。將m/z374.9 ＞ 304.9和374.9 ＞ 347.2分別用于定量和定性分析，質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 丙溴磷檢測的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometry parameters of profenofos determination

1.2.2 樣品提取與凈化 準(zhǔn)確稱取5.0 g柑橘樣品于50 mL具塞離心管中，加入10 mL乙腈，垂直振蕩5 min后加入2.0 g無水硫酸鎂及0.5 g氯化鈉垂直振蕩1 min，于10 000 r/min下離心5 min。取1.5 mL上清液，加入含有10 mg多壁碳納米管(內(nèi)徑為10～20 nm) 的2 mL離心管中，渦旋1 min，于4 000 r/min下離心5 min。取上清液，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相針式過濾器過濾后待測。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確稱取外消旋丙溴磷標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg于10.0 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成1 000.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于 –50 ℃避光保存。用乙腈將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成質(zhì)量濃度分別為5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000和5 000 μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液備用。稱取空白樣品，按1.2.2節(jié)方法進(jìn)行前處理后獲得空白基質(zhì)液，分別配制質(zhì)量濃度為5、10、20、50、100、200和500 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 田間試驗

于2019年9月在西南大學(xué)農(nóng)藥殘留試驗基地，使用50%丙溴磷乳油以有效成分質(zhì)量濃度為250 mg/L (最高推薦劑量) 的劑量在溫州蜜柑上均勻噴霧施藥1次。選取4棵生長狀態(tài)、大小接近的柑橘樹設(shè)置1個試驗小區(qū)。在處理小區(qū)相鄰位置設(shè)置1個試驗小區(qū)，小區(qū)間設(shè)隔離帶。分別于施藥后2 h和1、3、5、7、10、15、20、30、40 d采樣，每次制全果樣品3份。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 降解動態(tài)分析 通過一級反應(yīng)動力學(xué)方程(1)擬合丙溴磷2個對映體在柑橘中的殘留降解動態(tài)，通過半衰期 (t1/2) 表示降解速率(2)。

式中：ct代表時間t時分析物的殘留量，mg/kg；c0代表施藥后分析物的原始沉積量，mg/kg；k代表消解系數(shù)；t代表施藥后時間，d。

1.4.2 丙溴磷選擇性降解評價 采用對映體分?jǐn)?shù)(enantiomer fraction，EF) 來評價丙溴磷在柑橘中的立體選擇性降解，按 (3) 式計算。

式中：C+代表 (+)-丙溴磷的殘留濃度，C?代表 (?)-丙溴磷的殘留濃度。

1.4.3 分離參數(shù)計算 容量因子k' = (tn?t0)/t0；分離因子α=kn+1'/kn'；分離度Rs = 2(tn+1?tn)/(wn+1+wn)；其中t0為死時間，tn+1及tn分別為兩相鄰洗脫峰的保留時間，wn+1及wn分別為兩相鄰洗脫峰的基線峰寬[13]。

1.4.4 基質(zhì)效應(yīng) 基質(zhì)效應(yīng) (matrix effects，Me)是指共流出物影響分析物的離子化效率，使其分析信號增強(qiáng)或減弱的現(xiàn)象。按 (4) 式計算基質(zhì)效應(yīng)。

(4)式中：km代表基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，ks代表溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。當(dāng)Me為正值時為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，當(dāng)Me為負(fù)值時為基質(zhì)減弱效應(yīng)。基質(zhì)效應(yīng)在?20%～20%之間為弱基質(zhì)效應(yīng)；在?50%～ ?20%和20%～50%之間為中等基質(zhì)效應(yīng)；超過 ?50%或50%為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 丙溴磷對映體拆分條件優(yōu)化

2.1.1 不同手性固定相對丙溴磷對映體分離的影響 在兩種流動相組成條件下 [V(甲醇) :V(水) =70 : 30及V(乙腈) :V(水) = 40 : 60]，分別考察了7種不同手性固定相對丙溴磷對映體的拆分性能。結(jié)果顯示：ND(2)-RH柱 [固定相為直鏈淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)] 表現(xiàn)出最佳的拆分性能，在兩種流動相組成條件下均可實現(xiàn)丙溴磷對映體的基線分離 (圖1)，而其余手性固定相均未能實現(xiàn)該分離。

2.1.2 流動相組成及溫度對丙溴磷對映體分離的影響 在確定了最佳固定相后，首先考察了改性劑種類 (甲醇、乙腈) 對于丙溴磷對映體拆分的影響。結(jié)果顯示，2種改性劑均可實現(xiàn)丙溴磷對映體的基線分離，但甲醇具有更高的洗脫效率，可實現(xiàn)對丙溴磷對映體的快速分析。

其次以甲醇為改性劑，考察了流動相中甲醇所占體積比對丙溴磷拆分的影響。結(jié)果 (表3) 表明，隨著流動相中甲醇比例的降低，容量因子k值、選擇性因子α及分離度Rs逐漸增加，在流動相為V(甲醇) :V(水) = 70 : 30時可實現(xiàn)丙溴磷對映體的基線分離 (Rs = 1.51)。

在確定了最佳流動相組成后，考察了不同柱溫對丙溴磷拆分的影響。結(jié)果 (表3) 表明，隨著柱溫升高，容量因子k值呈下降趨勢，選擇性因子α及分離度Rs逐漸增加。通過比較分離度，在該試驗條件下僅有柱溫為35 ℃及40 ℃時分離度大于1.5，可實現(xiàn)丙溴磷對映體的基線分離，考慮到手性柱使用壽命 (推薦使用溫度小于40 ℃)，選擇柱溫為35 ℃進(jìn)行下一步試驗。

表3 流動相中甲醇所占體積比和柱溫對ND(2)-RH柱上丙溴磷對映體分離的影響Table 3 Effects of volume proportion of methanol in mobile phase and column temperatures on the enantiomeric separation of profenofos on ND(2)-RH column

2.1.3 丙溴磷對映體出峰順序 為準(zhǔn)確確定丙溴磷對映體在ND(2)-RH柱出峰順序，首先通過分離制備。獲得丙溴磷光學(xué)純單體，并通過旋光檢測器對其旋光方向進(jìn)行確認(rèn)；然后在流動相V(甲醇) :V(水) = 70 : 30、流速0.2 mL/min及柱溫35 ℃條件下，經(jīng)ND(2)-RH柱先后進(jìn)樣檢測。如圖2所示，在上述條件下，(+)-丙溴磷對映體在ND(2)-RH柱上優(yōu)先出峰。

2.2 前處理凈化條件優(yōu)化

柑橘樣品成分復(fù)雜，易產(chǎn)生較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，從而顯著影響分析的靈敏度。多壁碳納米管(Carbon nanotubes，MWCNTs) 是1991年Iijima發(fā)現(xiàn)的一種新型碳材料，因其獨(dú)特的納米中空結(jié)構(gòu)以及比表面積較大而在農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域引起高度關(guān)注[15]。本文參考Li等[16]方法，綜合比較了9種不同組合凈化劑對丙溴磷對映體回收率的影響。由圖3中可以看出，對于丙溴磷2個對映體而言，分別以100 mg GCB、50 mg GCB和50 mg GCB+50 mg PSA為凈化劑，丙溴磷對映體的回收率均小于70%；而以10 mg 4種不同內(nèi)徑規(guī)格 (內(nèi)徑分別為8～10 nm、10～20 nm、20～30 nm和30～50 nm) 的多壁碳納米管、以50 mg PSA及100 mg PSA為凈化劑，丙溴磷對映體回收率均大于70%，且內(nèi)徑為10～20 nm的多壁碳納米管回收率最高，大于80%。通過回收率的比較，最終選擇內(nèi)徑為10～20 nm的多壁碳納米管作為最優(yōu)凈化劑。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng) 從表4可以看出，丙溴磷對映體的基質(zhì)效應(yīng)在 ?20%～20%之間，在全果中表現(xiàn)出基質(zhì)減弱效應(yīng)，在果肉中表現(xiàn)出基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。由于基質(zhì)效應(yīng)不明顯，可以采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，但本文為確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液為基準(zhǔn)進(jìn)行了校正。

2.3.2 方法的線性范圍和靈敏度 由表4中可以看出：在2.5～250 μg/L線性范圍內(nèi)，丙溴磷對映體的全果及果肉基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積與對應(yīng)的質(zhì)量濃度間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r) 為0.999 6～0.999 9。以滿足農(nóng)殘分析回收率要求的最低添加水平為方法定量限 (LOQ)，丙溴磷對映體的LOQ為5 μg/kg。

表4 丙溴磷對映體的線性范圍Table 4 The linear range of the enantiomers of profenofos

2.3.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度 取空白柑橘全果及果肉樣品進(jìn)行3個水平 (10、200、1 000 μg/kg) 的添加回收試驗 (單一對映體為5、100、500 μg/kg)，每個水平重復(fù)5次，按本方法進(jìn)行測定。由表5可知，丙溴磷對映體的回收率為76%～83%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD) 為2.6%～6.0%。方法回收率和精密度良好，適用于柑橘中丙溴磷對映體的分析。

表5 丙溴磷對映體的添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 5 Recoveries and RSD of profenofos enantiomers

2.4 丙溴磷在柑橘中立體選擇性降解評價

在田間試驗中發(fā)現(xiàn)，丙溴磷對映體在柑橘中的降解規(guī)律符合一級反應(yīng)動力學(xué)方程 (圖4-A及圖4-B)，其降解方程及半衰期見(表6)。通過計算對映體之間的EF值 (圖4-C)，發(fā)現(xiàn)丙溴磷對映體在柑橘中的EF值均小于0.5，且整體上隨著時間呈現(xiàn)下降趨勢，在施藥后30 d最低，為0.43。表明丙溴磷對映體在柑橘中存在明顯的選擇性降解，(?)-丙溴磷易產(chǎn)生富集作用。

表6 柑橘全果中丙溴磷對映體的降解方程Table 6 Degradation equations of profenofos enantiomers in the whole fruit of citrus

手性農(nóng)藥在植物中發(fā)生選擇性降解可能是由于植物中眾多酶系的作用[2]，例如脂肪酶是一種廣泛存在于植物組織中的水解酶，其對手性化合物2,4-二氯苯氧丙酸甲酯 (2,4-DPM) 的水解具有對映體選擇性，優(yōu)先催化水解S-2,4-DPM[17]。不同種類的作物中含有的酶系種類往往存在差異，可能會使手性農(nóng)藥在作物中表現(xiàn)出不同的選擇性結(jié)果，例如 (?)-戊唑醇在葡萄中降解快于 (+)-戊唑醇[18]，而 (+)-戊唑醇在草莓中降解快于 (?)-戊唑醇[19]，因此在多種作物中開展選擇性降解研究同樣具有重要意義。目前關(guān)于丙溴磷對映體毒性研究主要集中于急性毒性[11]，而丙溴磷可在非靶標(biāo)生物的組織中富集[20]，在后續(xù)研究中應(yīng)當(dāng)開展丙溴磷對映體對于非靶標(biāo)生物的長期毒性試驗，從而為丙溴磷的全面風(fēng)險評估提供數(shù)據(jù)支持。

3 結(jié)論

本研究建立了丙溴磷對映體在柑橘中的殘留分析方法，利用所建立的方法測定了田間試驗條件下丙溴磷對映體在柑橘中的降解規(guī)律。結(jié)果顯示，丙溴磷對映體在柑橘中的降解具有選擇性，(+)-丙溴磷的降解速率快于 (?)-丙溴磷，從而導(dǎo)致(?)-丙溴磷的相對富集。研究結(jié)果可為手性農(nóng)藥對映體的環(huán)境行為研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。