一株雞源宋內志賀菌噬菌體的分離、生物學特性分析及預防試驗研究

代永聯 郝小靜 衣服德 白光燁 檀學進 馮永勝

摘? 要：從青島地區某雞場污水中分離出一株具有裂解特性的雞源宋內志賀菌噬菌體，暫編號為PG2-01。經透射電鏡觀察，該噬菌體為肌尾噬菌體，頭部直徑約70 nm，呈立體對稱二十面體。試驗測定，該噬菌體裂變能力強，潛伏時間短，能在較長時間內維持較強的裂解能力，能夠適應的酸堿度、溫度范圍較廣。預防試驗中，90%以上的雛雞能得到有效預防，這對該噬菌體的研究有深遠的實踐意義及很高的應用價值。

關鍵詞：宋內志賀菌;噬菌體;分離;裂解性;生物學特性

中圖分類號：S858.31 文獻標志碼：A 文章編號：1001-0769（2021）02-0082-05

動物和人類都能感染志賀菌，感染后會出現腹瀉等一系列癥狀，通常人們將志賀菌劃分為4個群，A群痢疾志賀菌、B群福氏志賀菌、C群鮑氏志賀菌和D群宋內志賀菌[1]。宋內志賀菌是導致禽類細菌性痢疾的主要病原菌之一，目前主要使用抗菌藥物防治禽類宋內志賀菌性痢疾，但由于細菌耐藥性的產生，多數抗菌藥物的防治效果差。大量使用抗生素，一方面會由于細菌耐藥性增強、藥物副作用大對畜禽健康造成危害，另一方面畜禽產品的藥物殘留會直接影響人類的食品安全。噬菌體廣泛存在于自然環境中，具有較強的特異性，可在特定細菌內增殖，裂解細菌，達到殺滅和清除細菌的目的。噬菌體在耐藥性細菌防治上具有很好的效果，無副作用，無藥物殘留，安全綠色，利于畜禽健康養殖。開展家禽宋內志賀菌性痢疾噬菌體的研究，對相關疾病的預防和治療具有很大的應用價值。

1? 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和噬菌體來源

宋內志賀菌菌種從發病雞分離純化取得，由上海派森諾基因科技有限公司經16S rDNA 測序鑒定;噬菌體分離自青島某雞場污水。

1.1.2 試劑

SM懸浮液;營養瓊脂（NA）半固體、固體、液體培養基;營養肉湯（NB）培養基;磷鎢酸（pH 6.7，濃度2%）;氯化鈉等試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體分離

取30 mL污水加入100 mL滅菌NB培養基，加入0.6 mL對數期宋內志賀菌菌液，36 ℃振蕩培養16 h，取出靜置60 min，12 000 r/min離心10 min，用0.22 um濾膜過濾上清液，取得噬菌體原液。取0.2 mL噬菌體原液與? ? ? ? 0.2 mL對數期宋內志賀菌菌液均勻混合，室溫靜置15 min，使細菌表面均勻吸附噬菌體，與7 mL 56 ℃的NA半固體培養基均勻混合，迅速倒入NA固體培養基上制成雙層平板，凝固后將平板倒置，36 ℃培養16 h，觀察噬菌斑。

1.2.2 噬菌體純化

挑取中間透亮、直徑約2 mm的單個噬菌斑，移入1 mL營養肉湯培養基中，30 ℃水浴30 min，使噬菌體充分逸出，然后按“1.2.1 噬菌體分離”介紹的方法離心過濾，與0.2 mL對數期宋內志賀菌菌液等量混合均勻，移入? 2 mL液體NA培養基中。依次純化5次，獲得高純度的噬菌體。

1.2.3 噬菌體觀察

在專用銅網上滴加效價為1×109 PFU/mL的噬菌體20 uL，室溫放置20 min，用濾紙吸除多余的液體，1.5%磷鎢酸負染15 min～ 20 min，吸除多余染色液并自然干燥，透射電鏡下觀察噬菌體形態。

1.2.4 噬菌體生物學特性觀察及效價測定

用無菌生理鹽水將0.2 mL純化的噬菌體按10-1～10-9濃度梯度稀釋，每個濃度分別取? ?0.2 mL，加入0.2 mL菌液混合均勻，按“1.2.1 噬菌體分離”介紹的方法鋪NA雙層板，每個濃度的噬菌體做3個平行，觀察噬菌斑情況。取濃度適當、噬菌斑數量在30～300個之間的平板進行計數，以3個平行板的噬菌斑計平均數，計算噬菌體效價（PFU/mL=稀釋倍數×平均板數×5）。

1.2.5 測定噬菌體最佳感染復數

取宋內志賀菌對數期菌懸液，按照0.001∶1、0.01∶1、0.1∶1、1∶1、10∶1、100∶1等比例加入噬菌體充分混合，靜置15 min，36 ℃培養15 h，按“1.2.1 噬菌體分離”介紹的方法離心過濾，采用雙層平板法，測定其最佳感染復數。

1.2.6 噬菌體一步式生長曲線測定

取對數期宋內志賀菌，根據感染復數加入噬菌體，36 ℃培養15 h，11 000 r/min離心1 min，棄上清，洗滌2次，36 ℃預熱NB培養基，重懸沉淀，培養，測定其效價，參照杜崇濤[2]推薦的方法評價，繪制一步式生長曲線，計算發生裂解的具體規模。

1.2.7 噬菌體對溫度和pH的敏感性測定

在50 mL NB中接種一個宋內氏志賀菌菌落，170 r/min培養12 h進入對數生長期，分別取0.5 mL至50 mL液體NA培養基中，于36 ℃、170 r/min培養15 h至對數生長前期，標記后各取0.3 mL置于96孔板中，用酶標儀測量OD600值，作為前期OD600值。

參照高苗等[3]介紹的方法對噬菌體溶液進行如下處理：（1）取7份1 mL噬菌體原液，分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃水浴鍋加熱30 min;（2）取7份1 mL噬菌體原液，加入pH范圍在4～10的30 ℃液體NA培養基中，在36 ℃的水中溫熱8 min;每次取0.3 mL測量OD600值，此處的OD600值稱為后期OD600值，前期OD600值和后期OD600值之間的差稱為OD600差。上述測試重復3次，獲得平均值。

1.2.8 噬菌體預防試驗

將60羽15日齡雛雞隨機分為3組，每組20羽。第1組為空白對照組，接種生理鹽水0.3 mL;第2組為感染對照組，接種0.3 mL效價為1.05×107 CFU/mL的宋內志賀菌;第3組為試驗組，每羽雞肌內注射0.3 mL效價為1.05×109 PFU/mL的噬菌體;24 h后各組用1.05×107 CFU/mL的宋內志賀菌攻毒，每羽雞接種0.3 mL，記錄各組雛雞死亡情況。

2? 結果

2.1 噬菌體的分離與純化

噬菌體PG2-01是通過雙層平板法將雞場污水和宋內志賀菌共同培養，并選擇中間透亮的最大噬菌斑，經反復純化獲得邊緣光滑的圓形透明噬菌斑，其直徑為1 mm～2 mm，詳細情況參見圖1和圖2。

2.2 噬菌體的電鏡觀察

透射電鏡觀察發現，PG2-01噬菌體頭部為二十面體立體對稱結構，直徑約為70 nm，有一可伸縮的尾鞘（圖3）。按照國際病毒分類委員會的分類規則，PG2-01屬于有尾噬菌體目。

2.3 噬菌體最佳感染復數測定

完成宋內志賀菌和噬菌體混合培養后采用雙層平板法對其效價進行測定（表1），當感染復數為0.01時，其效價為2.85×109 PFU/mL，是6個配比中最高的，因此0.01是PG2-01感染宋內志賀菌的最佳感染復數。

2.4 繪制噬菌體PG2-01一步生長曲線

按照圖4顯示的生長曲線發現，在整個感染過程中，PG2-01的裂解量大約為186，潛伏時間約為20 min，暴發時長大約為40 min，隨后進入穩定期。

2.5 噬菌體PG2-01敏感性測定

2.5.1 噬菌體PG2-01對溫度的耐受力

溫度范圍處在30 ℃～60 ℃的菌液， OD600值的前后差值處于0以下，即加入經過純化的噬菌體后，PG2-01將宋內志賀菌裂解并造成其死亡，間接表示噬菌體在溫度為30 ℃～ 60 ℃的環境中活性最高，30 ℃～40 ℃的環境中菌液濃度最小，表明在30 ℃～40 ℃環境中的PG2-01噬菌體擁有最高的自身活性以及最強的裂解能力。當處理溫度達到70 ℃后菌液OD600值在后期培養過程中明顯升高，說明噬菌體在溫度為70 ℃的環境中喪失自身活性（圖5）。

2.5.2 噬菌體PG2-01對酸堿的耐受能力

pH為5～8時，菌液OD600差值都在0以下，這表示此時PG2-01的殺菌能力最強，當pH為4、9和10時，差值回到0以上，說明PG2-01的殺菌能力在該pH范圍有所降低，pH低于4或高于9的環境不適合PG2-01殺菌和繁殖（圖6）。

2.6 噬菌體PG2-01對宋內志賀菌感染的預防效果

由表2可知，感染之前預防性肌內注射噬菌體可有效預防雛雞的感染，成活率比空白對照組的提高20%，對雛雞的保護率可以達到90%，而感染對照組的成活率僅有30%，與空白對照組的相比降低了40%。

3? 結論

PG2-01噬菌體能分解殺滅宋內志賀菌，具有生物特異性強、繁殖快、耐力好、環境適應性強、安全有效、成本低廉等優點，對雞有很強的保護作用，發展前景非常廣闊，具有很強的應用價值。

4? 討論

志賀菌會導致雞發生以腹瀉為主要癥狀的傳染病。不同日齡、品種的雞都可感染志賀菌，成年雞的死亡率和發病率低于雛雞的[4]。近年來，雞志賀菌的多重耐藥性呈明顯增高的趨勢，宋內志賀菌的感染比例也呈現增高趨勢，因此研究無抗藥性的志賀菌噬菌體勢在必行。作者對該噬菌體的環境耐受能力進行了研究，結果顯示其耐受能力較強，在較寬的pH及溫度范圍內都表現出極強的噬菌能力。預防性試驗發現，噬菌體PG2-01對雛雞具有較高的保護率，可以有效提高雛雞的成活率。

參考文獻

[1] 王建.我國宋內氏志賀菌流行特征、耐藥性及變異研究[D].北京：中國人民解放軍軍事醫學科學院，2016.

[2] 杜崇濤，大腸桿菌O157噬菌體的分離鑒定及其初步應用[D].吉林：吉林大學，2008.

[3] 高苗，楊金廣，劉旭，等.一株裂解性青枯雷爾氏菌噬菌體的分離及生物學特性分析[J].中國農業科學院，2015（7）：1330-1338.

[4] 王碩，雞源多重耐藥志賀菌病的流行病學調查[D].吉林：吉林農業大學，2018.