同域分布垂穗披堿草和達烏力披堿草遺傳多樣性和遺傳結構分析

路興旺 劉博 陶小燕 竇全文

摘 要：披堿草屬（Elymus L.）是禾本科（Poaceae）小麥族（Triticeae）中的一個多年生屬，該屬在青藏高原地區有廣泛分布，多數物種是草原和草甸的組成成分，許多種類為品質優良的牧草。垂穗披堿草（E. nutans）和達烏力披堿草（E. dahuricus）同為禾本科小麥族披堿草屬異源六倍體物種，染色體組組成皆為StYH。為探究垂穗披堿草遺傳多樣性形成的內在機制，該研究利用微衛星（SSR）分子標記，對采自青藏高原地區同域分布的垂穗披堿草和達烏力披堿草兩個居群共58個個體進行遺傳多樣性和遺傳結構分析。結果表明：8對引物在垂穗披堿草和達烏力披堿草擴增條帶分別為163條和124條，多態性位點百分率（PPB）分別為89.71%和76.07%，多態性信息含量（PIC）分別介于0.583～0.929和0.524～0.830之間。垂穗披堿草遺傳多樣性（He=0.69，I=1.34，Pp=100%）高于達烏力披堿草（He=0.53，I=0.80，Pp=93.75%）;同域分布的垂穗披堿草和達烏力披堿草居群，垂穗披堿草呈現出更高的遺傳多樣性。AMOVA分子變異顯示，兩個物種居群內遺傳變異分別80.92%和63.62%，但居群間遺傳分化水平較低。遺傳結構分析揭示兩個物種間有基因流存在。綜合分析結果認為，該地區種間雜交基因滲透引起的種內遺傳分化，在這兩個物種多樣性形成中可能起著重要作用。

關鍵詞： 垂穗披堿草， 達烏力披堿草， 遺傳多樣性， 遺傳結構， SSR標記

中圖分類號：Q948

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2021）03-0418-11

收稿日期：2019-11-15

基金項目：青海省重大科技項目（2018-NK-A2） [Supported by the Major Science and Technology Program of Qinghai Province （2018-NK-A2）]。

作者簡介： 路興旺（1990-），碩士研究生，主要從事牧草遺傳多樣性研究，（E-mail） 2268013394@qq.com。

通信作者：竇全文，博士，研究員，主要從事植物遺傳資源研究，（E-mail） douqw@nwipb.cas.cn。

Genetic diversity and genetic structure in populations of sympatric Elymus nutans and E. dahuricus

LU Xingwang1，2， LIU Bo1，2， TAO Xiaoyan1，2， DOU Quanwen1，3*

（ 1. Key Laboratory of Adaptation and Evolution of Plateau Biota， Northwest Institute of Plateau Biology， Chinese Academy of Sciences， Xining 810001，? China; 2. University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China; 3. Key Laboratory of Crop Molecular Breeding of Qinghai Province， Northeast Institute of Plateau Biology， Chinese Academy of Sciences， Xining 810008， China ）

Abstract：Elymus L. is a perennial genus in the Triaceceae family of Poaceae， which is widely distributed in the Qinghai-Tibet Plateau. Most species are components of grasslands and meadows， and many species are good quality pastures. Both E. nutans and E. dahuricus belong to Triteceae family （Elymus L.）， which are heterologous hexaploidy， with StYH chromosome composition. In order to further explore the intrinsic mechanism of genetic diversity of E. nutans， we used SSR molecular markers to analyze genetic diversities and genetic structures of 58 individuals collected from two codomain populations of E. nutans and E. dahuricus in the Qinghai-Tibet Plateau. The results were as follows： There were 163 and 124 amplified bands in 8 pairs of primers in E. nutans and E. dahuricus， respectively. Percentages of polymorphic loci （PPB） were 89.71% and 76.07%， respectively， and the polymorphism information contents （PIC） were between 0.583-0.929 and 0.524-0.830， respectively. The genetic diversities of E. nutans （He=0.69， I=1.34， Pp=100%） were higher than those of E. dahuricus （He=0.53， I=0.80， Pp=93.75%）， and E. nutans showed higher genetic diversity. The AMOVA molecular variation showed that the genetic variations within the population of the two species were 80.92% and 63.62%， respectively， while the levels of genetic differentiation among populations were low. Genetic structure analysis revealed the presence of gene flow existed between the two species. It is concluded that intraspecific genetic differentiation caused by interspecific hybridization， and may play an important role in the diversity formation of these two species.

Key words： Elymus nutans， Elymus dahuricus， genetic diversity， genetic structure， SSR marker

垂穗披堿草（Elymus nutans）屬禾本科（Poaceae）、小麥族（Triticeae）、披堿草屬（Elymus L.）多年生物種，在青藏高原地區分布范圍很廣，從海拔1 000 m谷地至海拔5 000 m的高山均有分布（Lu，1993）。垂穗披堿草呈現廣泛的生態適應性和極強的抗旱、抗寒性（Ren et al.，2010）。在高寒地區，垂穗披堿草生長旺盛，特別適合作為草場優質牧草，同時其草種被人工馴化后，被廣泛應用于青藏高原生態草地的修復治理以及人工草地的建制（馬玉壽等，2006;梁國玲等，2011）。達烏力披堿草（Elymus dahuricus）與垂穗披堿草同屬披堿草屬，都為異源六倍體物種（2n=42），在染色體組成上與垂穗披堿草相同，染色體組合為StStHHYY。達烏力披堿草作為優良牧草，廣泛分布于中亞、俄羅斯、蒙古、中國、韓國、日本和印度北部（Baum et al.，2011;顏濟和楊俊良，2013）。相對于垂穗披堿草，達烏力披堿草在青藏高原地區分布區域較小，局部區域與垂穗披堿草重疊分布。利用SSR和ISSR標記研究表明我國境內達烏力披堿草遺傳多樣性較高;青海高原東部及周邊地區是我國達烏力披堿草發生分化的地理分界區域，且在該地區發現特殊的分化類型（李永祥，2005）。

青藏高原垂穗披堿草具有豐富的遺傳變異特性，無論在形態學（張建波等，2009;德英等，2011;陳仕勇等，2016）、細胞學（Dou et al.，2009，2011）、生化標記（Miao et al.，2011）、分子標記（Chen et al.，2009;Yan et al.，2009;Chen et al.，2013;彭語洛等，2018）等方面，垂穗披堿草均呈現出豐富的遺傳變異特性。而達烏力披堿草僅在遺傳多樣性研究評價方面有少量報道（李永祥等，2005）。前人研究認為地理環境因素在垂穗披堿草遺傳多樣形成中起著重要作用（嚴學兵等，2007;Chen et al.，2009），環境因素在長期自然選擇過程中可以塑造不同生態型的多樣性形成，但是物種內在的遺傳多樣性形成及維持機制對物種多樣性形成起著決定作用，而關于這方面的研究鮮有報道。由于垂穗披堿草和達烏力披堿草染色體組成相似，且同域分布時兩個物種所處外界環境相同，因此本研究通過比較分析兩個同域分布物種的遺傳多樣性及遺傳結構，旨在深入了解種間雜交基因滲透在青藏高原地區同域分布的垂穗披堿草和達烏力披堿草遺傳多樣性形成的內在機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料采自青藏高原青海湖地區同一區域，材料來源和編號如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 基因組總DNA提取 取垂穗披堿草和達烏力披堿草各20粒種子，單粒置于培養皿中，當種子萌發長出幼根時，移栽到瓦盆中，當其長出3～4片葉子時，采用改良CTAB法（Allen et al.，2006）提取基因組總DNA。提取的DNA濃度和質量用紫外分光光度計（Nanodrop2000c，Thermo Scientific，Wilmington，DE，USA）和1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 多態性引物篩選 選用53對老芒麥SSR引物（Lei et al.，2014）和37對EST-SSR引物（Zhou et al.，2016），以及對應的優化反應條件和體系，隨機挑選5份垂穗披堿草和5份達烏力披堿草DNA進行PCR擴增。待擴增完成后，應用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，篩選出擴增條帶清晰、雜帶少、擴增結果穩定的引物，待用。

1.2.3 SSR擴增和PAGE電泳 擴增體系和反應程序如下：反應總體積25 μL，其中含Takara公司的10×PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol·L-1的dNTP 2.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板（50 ng·μL-1）1 μL，rTaq酶0.3 μL，dd H2O補足25 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，50 ℃/60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環;72 ℃延伸10 min。PCR產物采用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，300 V電壓下電泳50 min，嗅化乙錠（EB）染色，并用BIO-RAD自動凝膠成像系統照相保存。

1.2.4 數據分析 SSR為共顯性分子標記，依據PAGE電泳圖讀取基因型數據，參照夏寒冰等（2009）提出的分子標記基因型數據轉換為二元矩陣方法，將得到的“0、1”二元矩陣數據導入NTSYS-pc軟件。在NTSYS軟件中基于Dice遺傳相似系數（GS值），采用非加權平均法（UPGMA）作聚類分析;利用POPGENE1.32軟件計算等位基因（Na）、有效等位基因（Ne）、期望雜合度（He）、觀察雜合度（Ho）、香農多樣性指數（I）、多態性位點百分率（Pp）和多態性信息含量指數（PIC）;利用ARLIQUIN 3.5對群體進行分子方差分析（AMOVA），計算居群間和居群內分化系數，并作比較。

2 結果與分析

2.1 SSR多態性引物篩選

本研究選出8對擴增條帶清晰、多態性良好的引物（表2），對同域分布的垂穗披堿草和達烏力披堿草進行SSR電泳分析。

2.2 SSR多樣性分析

在90對SSR引物中，篩選出8對擴增條帶清晰且穩定的多態性引物，8對SSR引物在垂穗披堿草中擴增片段介于100～500 bp之間（圖1）。在33份垂穗披堿中（居群1和居群2）共檢測到243條帶，每個引物擴增產生的多態性條帶在22～41條，平均每個引物產生30.38條帶，其中多態性條帶為27.25條;每個引物多態性百分率在57.14%～100%之間，平均多態性條帶百分率為89.71%，多態性信息含量（PIC）在0.583～0.924之間，平均值為0.841（表3）。在25份達烏力披堿草（居群1和居群2）中擴增片段在100～500 bp之間，共檢測到163條帶，其中多態性條帶為124條，平均多態性位點百分率為76.07%，每個引物產生的多態性條帶在6～26條，平均每個引物產生20.37條帶，多態性條帶15.5條;多態性信息含量（PIC）在0.524～0.830之間，平均值為0.708（表3）。表3表明垂穗披堿草的擴增條帶多態性顯著高于達烏力披堿草。

2.3 遺傳相似系數及聚類分析

在NTSYS軟件中基于Dice遺傳相似性系數（GS值）計算同域分布垂穗披堿草和達烏力披堿草居群的遺傳相似系數。總群體遺傳相似系數（GS）在0.083～0.919之間，變幅為0.836，平均值為0.434。居群1，30份供試材料間的GS值在0.091～0.880之間，平均GS值為0.487;居群2，28份供試材料之間的遺傳相似性系數在0.125～0.966之間，平均值為0.489。垂穗披堿草和達烏力披堿草遺傳相似性系數在0.083～0.919之間，變幅為0.836，平均值為0.434。在垂穗披堿草材料中，遺傳相似性系數在0.071～0.919之間，平均值為0.426;達烏力披堿草材料中，遺傳相似性系數在0.095～0.966之間，平均值為0.604。

基于遺傳相似系數GS，采用UPGMA法可以將垂穗披堿草和達烏力披堿草明顯分開（圖2、圖3）。

2.4 遺傳多樣性分析

POPGENE分析結果（表4）表明，同域分布垂穗披堿草的各個多樣性指數都顯著高于達烏力披堿草。居群1垂穗披堿草的多樣性指數（Na=4.63，Ne=3.00，He=0.61，I=1.15，Pp=100%）均大于達烏力披堿草（Na=2.50，Ne=2.17，He=0.49，I=0.77，Pp =87.5%）;居群2垂穗披堿草多樣性指數（Na=6.00，Ne=4.11，He=0.77，I=1.53）也均大于達烏力披堿草（Na=2.50，Ne=2.25，He=0.56，I=0.77）。從類群水平來看，垂穗披堿草的遺傳多樣性平均值（Na=5.32，Ne=3.56，He=0.69，I=1.34，Pp=100%）明顯大于達烏力披堿草多樣性指數平均值（Na=2.50，Ne=2.21，He=0.53，I=0.80，Pp=93.75%）。

2.5 兩披堿草種內居群遺傳分化

居群遺傳結構分析結果（表5）表明，兩種披堿草均存在居群遺傳分化，垂穗披堿草的居群分化系數（Gst= 0.034）明顯低于達烏力披堿草（Gst= 0.070），表明這兩種披堿草的種內居群間遺傳變異占總遺傳變異的3.4%和7.0%，各自的絕大多數變異來自于各居群內（96.6%和93%）。根據遺傳分化系數（Gst）計算得到兩物種的居群間基因流較顯著，分別為Nm=9.030和Nm=5.053。不同位點居群遺傳分化程度存在差異，在垂穗披堿草居群間，位點ES-82和ESGS-328遺傳分化程度最高（Gst=0.051），位點ESGS-117遺傳分化程度最低（Gst=0.014）;在達烏力披堿草中，位點ES-82的分化程度最高（Gst=0.248），ESGS-117的遺傳分化程度最低（Gst）=0.031。

分子方差分析結果（表6）表明，垂穗披堿草和達烏力披堿草的遺傳變異主要存在于居群內。垂穗披堿草居群內遺傳變異水平（80.92%）大于達烏力披堿草居群內（63.62%），垂穗披堿草種內居群間的遺傳變異固定指數（Fst=0.19）低于達烏力披堿草種內居群間（Fst=0.36），兩物種種內的居群遺傳分化均達到顯著水平（P<0.001）。AMVOA分析得到的遺傳變異固定指數（Fst）和Wright的F統計量的Fst相當，都可得到不同地理分布居群間的基因流。根據公式Nm=0.25（1- Fst）/Fst，得到垂穗披堿草居群間的基因流（Nm=1.066）顯著大于達烏力披堿草居群間的基因流（Nm=0.444），且兩者均低于各自基于Gst計算的基因流（表5），由此說明地理居群間發生基因交流不顯著，對居群的遺傳分化并不能起到重要的作用。

2.6 同域分布居群披堿草種間遺傳分化

從表7結果可以看出，同域分布披堿草種間的遺傳分化系數平均僅為0.054，說明同域分布的垂穗披堿草和達烏力披堿草居群的遺傳多樣性主要存在于兩近緣種內（94.6%）， 僅有5.2%分布于兩物種間;同域分布的種間的基因流（Nm）達到了4.443，說明在同域分布的這兩種披堿草屬種間存在明顯的基因交流;兩個地區的同域分布的居群種間遺傳分化分別為0.057和0.050，二者的差異程度不明顯，這兩種披堿草的基因流（Nm）很接近，分別為4.136和4.750，說明不同地區同域分布的這兩種披堿草種間基因有明顯基因流且交流程度很接近。

3 討論與結論

高原地區垂穗披堿草呈現豐富的遺傳變異性，對于該地區垂穗披堿草遺傳多樣性研究一向受到高原生態學家和牧草育種者的重視。Yan et al.（2009）對來自青藏高原不同海拔高度的14個垂穗披堿草居群共300多個個體，利用AFLP標記進行了遺傳多樣性評價，結果揭示不同居群位點多態性比例在33.21%～77.80%之間，總體為73.52%;基因多樣性指數（He）在0.219 4～0.359 2之間，總體為0.428 5;香農多樣性指數（I）在0.355 0～0.549 1之間，總體為0.619 8。Chen et al.（2013）對來自不同海拔高度的50多份垂穗披堿草材料，利用SSR標記進行了遺傳性評價，結果揭示不同居群間位點多態性比例在54.86%～74.31%之間，基因多樣性指數在0.162 9～0.198 7之間，香農多樣性指數在0.257 9～0.311 9之間。我們利用SSR標記對來自2個不同居群的58個個體遺傳多樣進行檢測，結果顯示平均位點多態性比例達93.75%，基因多樣性指數在0.61～0.77之間，總體為0.69，香農多樣性指數在1.15～1.53之間，總體為1.34。在本研究中揭示的垂穗披堿草遺傳多樣性指標均高于前人的結果，這與不同研究中采用的分子標記類型不同有關，因為不同分子標記類型，多態性高低不同，最終導致研究結果差異的出現。Yan et al.（2009）利用AFLP標記得出多態性位點比例在66.3%～83.4%之間，平均為75.0%。本研究中SSR標記多態性位點比例在51.2%～96.2%之間，平均為90.4%。Chen et al.（2013）利用的SSR標記來源于普通小麥和Elymus alaskanus，在垂穗披堿草中位點多態性比例為66.7%～100%，平均為91.4%，但是平均多態性條數（7.33）和多態性信息含量（0.224）遠低于本研究中SSR標記揭示的結果（分別為27.3和0.84）。究其原因，是因為本研究中利用的SSR標記來自于和垂穗披堿草同域分布的近緣物種老芒麥（E. sibiricus），因此，這些SSR標記在垂穗披堿草中更容易擴增出基因組中存在的多態性位點。

本研究揭示了垂穗披堿草遺傳多樣性高于同域分布的達烏力披堿草，但是在遺傳結構上兩個物種有相似之處。垂穗披堿草和達烏力披堿草自交結實率很高，為典型的自花授粉植物（Lu， 1993;德英等，2015）。通常自花授粉植物的遺傳結構模式中，大部分的遺傳變異應存在于居群間（Fahima et al.，1999），但本研究對青藏高原地區同域分布垂穗披堿草和達烏力披堿草遺傳結構分析表明，垂穗披堿草和達烏力披堿草居群內遺傳變異（96.6%和93.0%）顯著高于居群間遺傳變異（3.4%和7.0%），遺傳變異主要存在于居群內個體間。AMOVA分析表明，垂穗披堿草和達烏力披堿草居群內遺傳變異分別為80.92%和63.62%，居群間遺傳變異僅為19.08%和36.38%。也有研究顯示，利用不同遺傳標記也揭示垂穗披堿草居群內部遺傳多樣性高于居群間的遺傳結構特性（Yan et al.，2009;Chen et al.，2013）。Yan et al.（2010）進一步對高原地區垂穗披堿草遺傳結構分析，認為由牲畜放牧帶動種子產生的強基因流有可能是造成這種結果的原因。垂穗披堿草形態學顯著區別于達烏力披堿草，垂穗披堿草下垂以及長的穎芒等特性似乎有利于種子通過動物毛發進行傳播，但是達烏力披堿草直立、短芒或無芒的穗型似乎不利于這種傳播方式。老芒麥為垂穗披堿草近緣物種，同樣為青藏高原廣為分布的優質牧草，老芒麥在外部形態上與垂穗披堿草非常相似，野外環境很難從形態學上區分二者。李永祥（2005）對中國境內老芒麥（包括來自青海的老芒麥居群）進行了遺傳結構分析，結果表明老芒麥符合自花授粉植物的遺傳結構特點，居群內遺傳多樣性指數為0.30，居群間為0.41，占全部多樣性的58%。同為和垂穗披堿草形態相似的優質牧草物種，但老芒麥和垂穗披堿草在遺傳結構特性上并不一致。由此我們推測，高原地區垂穗披堿草和老芒麥的群體遺傳結構可能并不被流動放牧顯著影響。

達烏力披堿草為達烏力披堿草復合群下的一個物種，達烏力披堿草復合群包含披堿草、麥賓草（Elymus tangutorum）、肥披堿草（E. excelsus）、圓柱披堿草（E. cylindricus）等（盧生蓮等， 1987; Lu， 1993; Baum et al.， 2011; 顏濟和楊俊良， 2013）。Agafonov（2001）對達烏力披堿草復合群物種的種間從形態學、貯藏蛋白和分子等三個不同水平上進行了詳細的研究， 建議在合適的范圍內定義為種內關系。李永祥（2005）利用SSR和ISSR對中國境內達烏力披堿草復合群種間親緣關系進行了研究，結果表明在SSR和ISSR水平上幾乎無法區分達烏力披堿草和圓柱披堿草。在本研究中達烏力披堿草取樣地區為達烏力披堿草復合群物種多樣性分布地區，同域分布有圓柱披堿草、麥賓草、肥披堿草等，同時考慮到該地區為達烏力披堿草復合群在該地區有特殊分化類型存在（李永祥，2005），因此，我們認為本研究中揭示的達烏力披堿草遺傳多樣性特性和遺傳結構特點更有可能歸因于達烏力披堿草居群內部已經存在的遺傳分化。同樣，我們推測同域分布的垂穗披堿草居群內存在的大量遺傳變異，可能來源于該群體中存在的不同遺傳分化類型。

披堿草屬物種呈現復雜的網狀進化特征，不同物種間雜交基因滲透普遍存在，種間雜交基因滲透在披堿草屬物種多樣性及遺傳多樣性形成中起著重要的作用（Sun et al.，2014; Wu et al.， 2016）。青藏高原地區為披堿草屬物種多樣性分布區域，在該地區存在豐富四倍體和六倍體披堿草屬物種（盧生蓮等，1987;劉尚武等，1999），研究表明垂穗披堿草和13種四倍體披堿草和4種六倍體披堿草物種間很容易雜交獲得種子（Lu， 1993），另外在該區不同披堿草屬物種間天然雜種高頻率發生（相吉山，2008;劉曉燕，2017;陳麗麗等，2018;路興旺等，2019）。同倍性或不同倍性物種間雜交在后代中產生較高的染色體變異（Lipmma et al.， 2013;Chester et al.， 2012），在我們的前期研究中發現垂穗披堿草群體中存在高頻率染色體變異（Dou et al.， 2009， 2017）。因此，我們認為垂穗披堿草與同域分布的近緣物種間存在的種間雜交基因滲透有可能對于該群體的遺傳分化起著重要的作用。與垂穗披堿草相比，達烏力披堿草復合群物種的核型相對保守，該復合群物種均具有2對物種特異性易位染色體存在（Dou et al.， 2011; Yang et al.， 2017），物種特異性易位染色體被認為在多倍體形成初期在核質互作中對細胞質的育性恢復和基因組穩定化選擇中起著重要的作用（Gill， 1991），因此，達烏力披堿草和垂穗披堿草雖然都為基因組相似的同倍體物種，但是達烏力披堿草特殊的核質穩定機制可能對與不同披堿草物種間雜交基因滲透具有一定的阻礙作用，達烏力披堿草種群遺傳分化更傾向與復合群內其他物種間的雜交基因滲透。本研究表明，同域分布的垂穗披堿草遺傳多樣性高于達烏力披堿草，相對于達烏力披堿草，這可能是由于垂穗披堿草更易與其他更多物種發生雜交基因滲透;不同居群中垂穗披堿草和達烏力披堿草之間有基因流存在，但是達烏力披堿草特殊的核質互作機制，可能在維持達烏力披堿草物種穩定性方面起著關鍵的作用。

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（責任編輯 李 莉）