基于葉綠體DNA的黃土高原特有植物蕤核的譜系地理學

劉家奇 付孟嬌 吳海洋 田斌

摘 要：該文利用母系遺傳的葉綠體DNA片段（psbA-trnH，psbI-psbK和psbJ-petA）對黃土高原地區的特有植物蕤核（Prinsepia uniflora）進行譜系地理學研究，以揭示其現有的遺傳結構和群體歷史動態。結果表明：（1）蕤核自然種群總的遺傳多樣性較高（HT

=0.796），而種群內的遺傳多樣性較低（HS =0.276）。（2）分子變異分析（AMOVA）表明，分布區域內蕤核具有較高的遺傳分化（FST = 0.674），且遺傳變異主要存在于種群間（67.4%）。（3）Mismatch分析和基于MaxEnt的不同歷史時期生態位模擬結果表明，盡管蕤核的核心適生范圍沒有經歷太大的變化，但其種群在最后一次大冰期結束后仍存在一定程度上的擴張。綜上結果認為，與大多數分布在我國北方地區的許多植物類群一樣，蕤核很可能是采取冰期在鄰近或者就地避難，冰期過后局部回遷的方式應對第四紀的氣候波動。

關鍵詞： 蕤核， 黃土高原， 葉綠體DNA， 譜系地理學

中圖分類號：Q948.2

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2021）03-0396-08

收稿日期：2019-12-16

基金項目：國家自然科學基金（41861008）? [Supported by National Natural Science Foundation of China（41861008）] 。

作者簡介： 劉家奇（1994-），碩士研究生，研究方向為林木遺傳育種、植物群體遺傳，（E-mail）2047223903@qq.com。

通信作者：田斌，博士，副教授，研究方向為植物學、林木遺傳育種、植物群體遺傳學，（E-mail）tianbin@swfu.edu.cn。

Phylogeography of the Loess Plateau endemic plant Prinsepia uniflora inferred from the chloroplast DNA

LIU Jiaqi， FU Mengjiao， WU Haiyang， TIAN Bin

（ Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration on Biodiversity Conservation in Southwest China （Southwest Forestry University）， Kunming 650224， China ）

Abstract：To reveal the historical dynamics of the population and existing genetic structure， maternal chloroplast DNA fragments （psbA-trnH， psbI-psbK and psbJ-petA） were used to study the phylogeography of Prinsepia uniflora， a kind of endemic plant distributed in the Loess Plateau. The results were as follows： （1） Total genetic diversity of P. uniflora was high （HT = 0.796）， but genetic diversity within species was low （HS= 0.276）; （2） The molecular variation analysis （AMOVA） showed that there was a high genetic differentiation within P. uniflora （FST = 0.674）， and the genetic variation was mainly between populations （67.4%）; （3） Mismatch analysis and MaxEnt based ecological niche simulation results in different historical periods showed that although the core suitable range of P. uniflora did not change much， population still expanded to some extent after the end of the Last Glacial Maximum （LGM）. Our study indicated that， like most of the plant groups distributed in the northern regions of China， P. uniflora probably responded to the Quaternary climatic fluctuations by taking refuge nearby or in situ during the glacial period and locally recolonizing in following post-glacial period.

Key words： Prinsepia uniflora， Loess Plateau， chloroplast DNA， phylogeography

伴隨地質歷史事件的生物類群群體歷史動態變化對理解現今的生物分布和多樣性格局，以及預測未來氣候變化條件下的物種響應有著非常重要的意義（Davis et al.，2005）。第四紀（約200萬年前）以來，全球范圍內出現了多次氣候的周期性波動，其典型事件是冰期和間冰期交替出現，對植物類群現今的地理分布和種群遺傳格局造成了深刻影響（Comes & Kadereit，1998;Provan & Bennett，2008）。

越來越多的證據表明，盡管以黃土高原為代表的中國北部沒有像歐洲和北美那樣大規模冰川發育的自然地理條件，但是第四紀氣候的反復變化，也對分布在這一地區的植物地理分布格局和群體遺傳結構產生了一定影響（Qiu et al.，2011;Liu et al.，2012）。其具體表現為種群內遺傳多樣性降低，以及分布范圍的反復擴張、收縮或生境破碎化。并且多數研究表明中國北方現存的植物物種在冰期存在多個避難所，冰期結束后也僅僅是在局部范圍內回遷（Chen et al.，2008;Tian et al.，2009;Fu et al.，2014;Zeng et al.，2015）。

蕤核（Prinsepia uniflora）隸屬于薔薇科李亞科扁核木屬，為中國的特有植物類群。在山西、內蒙古、陜西、甘肅、寧夏等黃土高原地區廣泛分布。該物種主要生于山坡、河谷等稀疏灌叢或干旱沙丘，海拔 900～1 100 m（Gu & Bartholomew，2003）。由于該物種具有一定的藥用和食用價值，加之黃土高原地區頻繁人類活動的影響，使其生存受到了嚴重的威脅。我們的野外調查發現，目前該物種自然群體片段化分布，并且種群內的植株數量非常有限。本研究擬利用3套葉綠體DNA片段去構建黃土高原特有種蕤核的譜系地理結構，結合生態位模擬的方法，試圖為黃土高原地區植被的歷史動態提供線索，并對該物種的有效保護提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

研究材料于2010—2017年采自陜西、甘肅、山西、青海，共采集蕤核18個種群144個個體（表1，圖1）。每個種群隨機采集4～13個個體，個體之間相隔至少100 m以上。采集生長良好植株的新鮮嫩葉后立即用硅膠干燥，帶回實驗室存放于-20 ℃冰箱備用。憑證標本貯藏于西南林業大學標本館。

1.2 DNA提取與PCR擴增

采用改良的CTAB法（Doyle JJ & Doyle JL，1990）提取所有采集樣本葉片的總DNA。從候選的10對cpDNA通用引物篩選出具有多態性的引物，最終甄選出3對cpDNA引物（psbA-trnH、psbJ-petA、trnL-trnF）進行PCR擴增，引物序列見表2。PCR擴增反應體系為25 μL，內含2Taq MasterMix（Sangon Biotech）12.5 μL、正反向引物各1 μL（濃度為5 μmol·L-1）、植物總DNA模板1 μL以及雙蒸水9.5 μL。PCR擴增反應程序為94 ℃預變性4 min;94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，循環35次;72 ℃延伸7 min結束，4 ℃保存。多次實驗篩選出3對引物最佳的退火溫度均為52 ℃。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送測序公司進行雙向測序。

1.3 數據分析

經測序后得到的數據使用ClustalX 1.83 （Thompson et al.，1997）以及MEGA 7.0.26 （Kumar et al.，2016）進行序列的多重比對，同時將原始峰圖作為參照進行手工校對。所有的序列完全校對正確后，再用DnaSP 5.10 （Librado & Rozas，2009）程序來統計葉綠體DNA單倍型。

葉綠體DNA單倍型的關系通過NETWORK 4.1.6.3 （Bandelt et al.，1999）軟件來檢測。我們選擇最大簡約法以最小生成樹為基礎構建單倍型中央連接網狀圖。在分析過程中點突變和缺失被平等處理，并且假設每個突變之間是相對獨立的。種群內遺傳多樣性（HS）、總遺傳多樣性（HT）和物種層面上的種群分化水平GST和NST值均使用PERMUT （Pons & Petit，1996）軟件來估測和觀察葉綠體的變異情況。GST值計算只使用了單倍型頻率，而NST值則把單倍型之間的差異也計算在內。比較這兩個值可以看出單倍型變異在整個地理分布區的地理格局，如果NST值大于GST值，且達到顯著水平（P < 0.05），則表明關系相近的單倍型在相同的種群出現比在不同種群出現幾率大，說明存在著明顯的譜系地理結構。采用Arlequin 3.5.2 （Weir & Cockerham，1984）軟件的分子變異分析（analysis of molecular variance，AMOVA）對種群間和種群內的遺傳差異進行估算，其中顯著性檢驗使用隨機參數進行1 000次的置換檢驗。

1.4 生態位模擬

本研究通過最大熵模型（Phillips et al.，2006） （Maximum entropy;Maxent）對蕤核進行生態位模型預測來識別該物種在第四紀時的避難所和避難模式，推測大冰期后至今的歷史動態，以及未來在全球變暖的趨勢下該物種的潛在分布。蕤核的當前分布數據主要來自我們的野外調查采樣以及植物標本館記錄（www.cvh.ac.cn）。在去除重復的分布點后，得到35個當前的分布位置。基于4個時期（Last Interglacial，LIG、Last Glacial Maximum，LGM、Present and Future）背景下的各自19個氣候變量從WorldClim數據庫下載（www.worldclim.org），分辨率和大氣環流模型分別統一為2.5 arc-min （大約5 km）和CCSM4。根據Pearsons相關系數（r>0.9），對當前19個氣候變量中具有強相關性的變量排除，剩下的9個氣候變量用于模型創建。生態位模型創建在Maxent 3.3.3中進行，設置Random test percentage為25%，Replicates為10。

2 結果與分析

2.1 蕤核的單倍型分布

對蕤核cpDNA的3個片段psbA-trnH、psbJ-petA和psbK-psbI進行擴增測序的結果顯示：3個片段各出現1個、4個、1個變異位點（表3）。經過序列比對后的psbA-trnH、psbJ-petA和psbK-psbI 3對引物片段長度分別為495、801、244 bp，這3套葉綠體DNA片段的序列拼接在一起可得到1 540 bp的長度，一共識別出7種葉綠體單倍型H（1-7），存在5個點突變和4處插入缺失。

從蕤核葉綠體單倍型的分布圖（圖1）可以看出，共計8個種群只存在1種單倍型，另外有9個種群有2種單倍型，僅在1個種群中存在3種單倍型RLXX（H4、H5、H6）。單倍型H4出現的頻率最高。單倍型網狀圖顯示蕤核的單倍型成多元擴張分布，主要是以單倍型H4和H5為中心，由單倍型H4和H5向四周發散，然后衍生出單倍型H2、 H3這2個大的分布類型，并且多數單倍型之間僅有一步的變異（圖1）。

2.2 蕤核遺傳多樣性和遺傳結構分析

從表4可以看出，蕤核種群內遺傳變異百分比為32.59%，種群間遺傳變異量占總變異量的67.41%，種群間發生顯著的遺傳分化，FST=0.674 12（表4，P<0.001）。通過PREMUT程序計算得出其自然種群間遺傳多樣性HT（0.796）高于種群內的遺傳多樣性HS（0.276）。從所有的18個種群地理單元間遺傳變異性和分化系數顯示出NST（0.834）顯著高于GST（0.654）（P<0.01）。結果顯示，蕤核葉綠體單倍型有明顯的譜系地理學結構。

2.3 蕤核種群歷史分析

葉綠體單倍型的種群錯配的分布顯示單峰型（圖2），表明了蕤核種群經歷了種群的急速擴張性事件。基于計算所得的τ值為0.516，根據τ=2ut計算擴張經歷世代數t，其中u=2μkg。通過野外觀察，我們設定世代長度g為3 a，μ代表DNA平均變異速率，采用木本植物的進化速率，取已發表的平均變異速率的較高值：3～9×10-9變異/位點/年（substitution/site/year）。k表示序列總長度為1 540。計算得到擴張時間為18 614～8 272年前。

2.4 生態位模擬分析

生態位模型創建結果獲得了非常高的AUC（the Area Under the Curve）值（> 0.995）的支持。蕤核4個時期的潛在分布預測圖中清晰地展現了該物種在不同氣候背景下的分布格局。與現在（Present）的分布范圍相比，LIG和LGM時種群范圍并沒有出現較大的變化，其分布的核心區均在黃土高原，只是在最后一次冰期后出現了小幅度的適生區擴大。然而在未來（2070年）蕤核的分布范圍將會縮小（圖3）。

氣候因子Bio6（最冷月最低溫）和Bio15（降水季節變化）在生態位建模的4個時期，都表現出較高的貢獻率，尤其是LIG，Bio15的貢獻百分比達到了37.4%（圖4）。此外，Bio16（最濕季節降水量）、Bio13（最濕月降水量）和Bio14（最干月降水量）在現在和未來（Future）蕤核分布區模擬中占有較高的貢獻百分比（圖4）。

3 討論與結論

本研究發現蕤核具有明顯的譜系地理結構（NST = 0.834 >GST = 0.654， P < 0.01），并且有顯著的遺傳分化（FST=0.674 12， P<0.001）和較低的種群內遺傳多樣性（HS=0.276）。分子變異遺傳方差分析（AMOVA）的結果顯示，蕤核遺傳變異主要以種群間的變異為主，占67.41%。總的來說，植物種群的遺傳結構受到地質歷史氣候變遷、環境因素（如地勢條件、生境異質性）以及種子基因交流程度等諸多因素的影響。已有的研究表明，我國北方分布的植物類群由于第四紀冰期與間冰期的反復交替造成不同避難所之間的種群產生強烈的遺傳分化，并且降低了種群內的遺傳多樣性（Qian & Ricklefs，2000;Chen et al.，2008;Qiu et al.，2011;Zeng et al.，2015）。此外，我們在野外采樣過程中發現，蕤核現存的自然種群大多零星分布在黃土高原的中高海拔地區，種群規模相對較小。黃土高原溝壑縱橫的地貌和嚴重的水土流失可能加劇了蕤核不同種群之間的基因交流困難性，使得種群之間具有較大的遺傳分化。黃土高原地區長期而劇烈的人類活動可能是造成上述結果的另一重要原因。

從蕤核單倍型的network分析和地理分布來看，兩種古老單倍型H4和H5從東到西均有分布，其他衍生單倍型則是局限地分布于不同的地理區域，如單倍型H1、H3和H7僅分布在分布區西部的少數幾個種群。生態位模擬的結果也表明，在最后一次大冰期蕤核并沒有大規模的分布區范圍變化。Mismatch分析（錯配分析）表明蕤核種群經歷了近期的擴張事件。經推算的擴張時間為1.86萬～0.82萬年前，這與第四紀最后一次大冰期結束的時間（1.8萬～1.6萬年前）相吻合。因此，我們推測該物種在最后一次大冰期時，并沒有大規模的滅絕事件發生，而是在多個冰期避難所就地避難。不同地區避難的種群也很可能沒有經歷大范圍的擴張，僅僅回遷到鄰近地區。這一推測也和在該地區分布的其他重要樹種如虎榛子（Ostryopsis davidiana）（Tian et al.，2009）、 連翹（Forsythia suspensa） （Fu et al.，2014）、文冠果（Xanthoceras sorbifolium）（Zhu et al.，2019）等的研究結果相類似。本研究同樣支持了我國北方地區的許多植物類群并沒有像同緯度歐洲分部的植物一樣出現大規模的南遷避難，而是多采取鄰近或者就地避難的方式應對第四紀的氣候波動。

全球氣候變化下，很多生態敏感地區的動植物都有遺傳多樣性喪失甚至滅絕的風險（Vellend & Geber，2005）。對于黃土高原這一生態脆弱地區來說，分布在這一地區的特有動植物類群應該備受關注。我們對蕤核生態位模擬的結果顯示，不同的歷史時期，降水相關的生態因子都表現出較高的貢獻率。在未來全球氣候將會出現的增溫變干的趨勢下，蕤核適生范圍有可能急劇減小。加之其生存的黃土高原地區特殊的生境和強烈的人為干擾，這一黃土高原特有植物類群將面臨滅絕風險。結合蕤核種群遺傳結構結果，該物種具有較高的遺傳分化水平，并且多個種群均出現了獨有的葉綠體單倍型。因此，我們認為蕤核的多數種群均有保護價值，一方面應對現有的蕤核群體進行有效的保護，另一方面應加大對蕤核遺傳資源的收集，進行入庫保存。

參考文獻：

BANDELT HJ， FORSTER P， ROHL， A， 1999. Median-joining networks for inferring intraspecific phylogenies [J]. Mol Biol Evol， 16（1）： 37-48.

CHEN K， ABBOTT RJ，MILNE RI， et al.， 2008. Phylogeography of Pinus tabulaeformis Carr. （Pinaceae）， a dominant species of coniferous forest in northern China? [J]. Mol Ecol， 17（19）： 4276-4288.

COMES HP， KADEREIT JW， 1998. The effect of quaternary climatic changes on plant distribution and evolution [J]. Trends Plant Sci， 3（11）： 432-438.

DAVIS MB， SHAW RG， ETTERSON JR， 2005. Evolutionary responses to changing climate? [J]. Ecology， 86（7）：1704-1714.

DOYLE JJ， DOYLE JL， 1990. A rapid total DNA preparation procedure for fresh plant tissue [J]. Focus， 12：13-15.

FU ZZ， LI YH， ZHANG KM， et al.， 2014. Molecular data and ecological niche modeling reveal population dynamics of widespread shrub Forsythia suspensa （Oleaceae） in Chinas warm-temperate zone in response to climate change during the Pleistocene? [J]. Bmc Evol Biol， 14（1）： 1-13.

GU CZ， BARTHOLOMEW B， 2003. Prinsepia Royle [M]//WU ZY， RAVEN PH. Flora of China. Beijing： Science Press， 9; St. Louis： Missouri Botanical Garden Press： 389-391.

KUMAR S， STECHER G， TAMURA K， 2016. MEGA7：molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets? [J]. Mol Biol Evol， 33（7）： 1870-1874.

LIBRADO P， ROZAS J， 2009. DnaSP v5： a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data [J]. Bioinformatics， 25（11）： 1451-1452.

LIU JQ， SUN YS， GE XJ， et al.， 2012. Phylogeographic studies of plants in China： advances in the past and directions in the future? [J]. J Syst Evol， 50（4）： 267-275.

PHILLIPS SJ，ANDERSON RP， SCHAPIRE RE， 2006. Maximum entropy modeling of species geographic distributions? [J]. Ecol Model， 190（3-4）： 231-259.

PONS O， PETIT RJ， 1996. Measuring and testing genetic differentiation with ordered versus unordered alleles [J]. Genetics， 144（3）： 1237-1245.

PROVAN J， BENNETT KD， 2008. Phylogeographic insights into cryptic glacial refugia [J]. Trend Ecol Evol， 23（10）： 564-571.

QIAN H， RICKLEFS RE， 2000. Large-scale processes and the Asian bias in species diversity of temperate plants [J]. Nature， 407（6801）： 180-182.

QIU YX， FU CX， COMES HP， 2011. Plant molecular phylogeography inChina and adjacent regions： Tracing the genetic imprints of quaternary climate and environmental change in the worlds most diverse temperate flora? [J]. Mol Phylogenet Evol， 59（1）： 225-244.

THOMPSON JD， GIBSON TJ， PLEWNIAK F， et al.， 1997. The CLUSTAL_X windows interface： flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools? [J]. Nucl Acid Res， 25（24）： 4876-4882.

TIAN B， LIU R， WANG L， et al.， 2009. Phylogeographic analyses suggest that a deciduous species （Ostryopsis davidiana Decne.， Betulaceae） survived in northern China during the Last Glacial Maximum? [J]. J Biogeogr， 36（11）： 2148-2155.

VELLEND M， GEBER MA， 2005. Connections between species diversity and genetic diversity [J]. Ecol Lett， 8（7）：767-781.

WEIR BS， COCKERHAM CC， 1984. Estimating F-statistics for the analysis of population-structure [J]. Evolution， 38（6）： 1358-1370.

ZENG YF， WANG WT， LIAO WJ， et al.， 2015. Multiple glacial refugia for cool-temperate deciduous trees in northern East Asia： the Mongolian oak as a case study? [J]. Mol Ecol， 24（22）： 5676-5691.

ZHU RB， WANG Q， GUAN WB， et al.， 2019. Conservation of genetic diversity hotspots of the high-valued relic yellowhorn （Xanthoceras sorbifolium） considering climate change predictions? [J]. Ecol Evol， 9（6）： 3251-3263.

（責任編輯 何永艷）