異葉澤蘭的遺傳多樣性和居群歷史動態(tài)研究

潘躍芝 趙玉娟 龔洵

摘 要：異葉澤蘭屬于菊科澤蘭屬，是該屬分布海拔相對較高的植物，分布在青藏高原東部和橫斷山海拔1 700～3 000 m的地區(qū)。該文利用ycf6-psbM和rpl32-trnL兩個葉綠體DNA（cpDNA）片段以及核DNA片段ITS（nITS）作為分子標記，研究了異葉澤蘭的遺傳多樣性及其分布特征，探討了其居群歷史動態(tài)。結(jié)果表明：（1）葉綠體片段聯(lián)合分析結(jié)果顯示，異葉澤蘭在物種水平遺傳多樣性水平不高，單倍型多態(tài)性指數(shù)（Hd）為0.656，核苷酸多態(tài)性（π）為0.001 61;而ITS的基因型多態(tài)性指數(shù)（Hd）為0.687，核苷酸多態(tài)性（π）為0.002 35。（2）cpDNA和nITS分析結(jié)果均顯示，異葉澤蘭居群水平總的遺傳多樣性大于居群內(nèi)平均遺傳多樣性，遺傳變異主要發(fā)生在居群間，居群間存在明顯的遺傳分化（cpDNA：Gst=0.679，Nst=0.655，F(xiàn)st=0.655;nITS：Gst=0.543，

Nst=0.370，F(xiàn)st=0.584），但是由于Nst值小于Gst值，因此異葉澤蘭的分布不具有明顯的譜系地理結(jié)構(gòu)。（3）基于單倍型地理分布以及Network分析推測，橫斷山區(qū)南部（川西南-滇西北）和云南中部可能是異葉澤蘭在第四紀冰期時的兩個避難所，中性檢驗和失配分析的結(jié)果支持異葉澤蘭在冰期后未發(fā)生過居群擴張。

關鍵詞： 異葉澤蘭， 遺傳多樣性， 居群歷史動態(tài)， 橫斷山區(qū)， 避難所

中圖分類號：Q948.15

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2021）03-0340-11

收稿日期：2019-12-27

基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2017YFC0505200） [Supported by the National Key Research and Development Program of China （2017YFC0505200）]。

作者簡介： 潘躍芝（1973-），博士，副研究員，主要從事植物進化與遺傳資源評價研究，（E-mail）panyuezhi@mail.kib.ac.cn。

通信作者：龔洵，博士，研究員，主要從事植物進化與保護遺傳學研究，（E-mail）gongxun@mail.kib.ac.cn。

Genetic diversity and population demography of Eupatorium heterophyllum （Asteraceae）

PAN Yuezhi， ZHAO Yujuan， GONG Xun

（ Yunnan Key Laboratory for Wild Plant Resources， Kunming Institute of Botany， Chinese Academy of Sciences， Kumming 650201， China ）

Abstract：Eupatorium heterophyllum， belonging to Eupatorium （Asteraceae）， is distributed in the eastern Qinghai-Tibet Plateau and Hengduan mountain， and has relatively high elevation in comparison with those of other species within this genus. A survey of two chloroplast DNA （cpDNA） fragments （ycf6-psbM and rpl32-trnL）， and one nuclear DNA fragment ITS （nITS） were carried out to assess the genetic diversity and infer the population demography of E. heterophyllum. The results showed that the haplotype diversity （Hd） of combined cpDNA fragments was 0.656， and the nucleotide diversity （π） was 0.001 61 at the species level. These two index values of ITS were 0.687 and 0.002 35， respectively. All these data showed that E. heterophyllum had relatively low level of genetic diversity. Both cpDNA and ITS data show that the total genetic diversity of E. heterophyllum was higher than the average value of populations， and the genetic variations occurred mainly among populations. Significant genetic differentiation exists among populations （cpDNA： Gst=0.679， Nst=0.655， Fst=0.655; nITS： Gst=0.543， Nst=0.370， Fst=0.584）. However， there was no obvious phylogeographical structure occurred in E. heterophyllum （Nst < Gst）. Both the pattern of haplotype distribution and Network structure of haplotypes indicated that the southern Hengduan? mountian and central Yunnan Province were probably the two refugia for E. heterophyllum during the Quaternary Glaciation period. It is infered that E. heterophyllum has not undergone population expansion after glacial period which was supported by the neutral test and mismatch analysis.

Key words： Eupatorium heterophyllum， genetic diversity， population demography， Hengduan mountains， refugium

異葉澤蘭（Eupatorium heterophyllum）屬于菊科澤蘭屬（Eupatorium），該屬曾被認為是分布在美洲及歐亞大陸的菊科大屬，約600種，被人們所熟知的外來入侵物種紫荊澤蘭（E. adenophora）曾被置于該屬（林容等，1985;Chen et al.， 2011）。但是，后來該屬被重新界定為僅分布在歐亞大陸的北極-第三紀分布小屬，包含45個種左右（King & Robinson， 1970）;而分布于中南美洲的類群不再被歸入該屬內(nèi)，如紫荊澤蘭被歸并到紫莖澤蘭屬（Ageratina），定名為A. adenophora（King & Robinson， 1970;Chen et al.， 2011）。被重新定義的澤蘭屬屬北溫帶類群，北美分布有27種，東亞分布有25種，1種分布在歐洲， 是一個典型的東亞北美間斷分布類群（Schilling et al， 1999; Ito et al.， 2000）;在中國的大陸和臺灣地區(qū)約分布有14種，其中6種為特有種（Chen et al.， 2011）。系統(tǒng)發(fā)育和植物地理學分析表明，該類群為北美起源和分化，其一分支在6.18～11.6 Ma（晚第三紀）時經(jīng)白伶海峽陸橋擴散至歐亞大陸，隨后在亞洲經(jīng)歷了輻射演化（Schilling et al.， 1999; Schmidt & Schilling， 2000）。其中，東亞分布的種類在形態(tài)表型以及染色體核型上差異都比較小（Watanabe et al.， 1990），物種間可能存在自然雜交的現(xiàn)象（Schmidt & Schilling， 2000）。在中國分布的約14個種中，異葉澤蘭分布在青藏高原東部和橫斷山海拔1 700～3 000 m的地區(qū)，是澤蘭屬唯一的分布海拔較高的物種，生于山坡林下、林緣、草地及河谷（Chen et al.， 2011），其化學成分在不同居群間存在差異（Saito et al.， 2014）。

橫斷山區(qū)是泛北極植物區(qū)系的一個區(qū)（李錫文和李捷，1993）。該地區(qū)的種子植物區(qū)系基本上是溫帶性質(zhì)的， 尤其是北溫帶成分，這其中許多又是北極-第三紀植物，這類植物在中新世以后伴隨氣溫的急劇下降而南遷。秦嶺-黃河一線并環(huán)沿四川盆地可能是北極第三紀成分向喜馬拉雅-橫斷山遷移的主要路線（孫航， 2002）。該地區(qū)在第四紀冰期時未被統(tǒng)一的大冰蓋覆蓋，同時又受東亞季風氣候和印度季風氣候的影響，這給許多植物類群提供了避難所，尤其是海拔相對較低的地區(qū)（Qiu et al.， 2011;更吉卓瑪?shù)龋?018）。在冰后期，橫斷山區(qū)成為現(xiàn)代溫帶植物的重要起源地和輻射地（李錫文和李捷，1993;于海彬和張鐿鋰，2013），物種多樣性和遺傳多樣性都非常高（Yu et al.， 2019）。異葉澤蘭作為澤蘭屬在高海拔地區(qū)的分布物種，在第四紀冰期及冰期后存在怎樣的居群歷史動態(tài)，現(xiàn)有分布居群又具有怎樣的遺傳多樣性分布式樣。本文基于兩個葉綠體DNA片段（ycf6-psbM和rpl32-trnL）和核DNA片段ITS的測序數(shù)據(jù)，利用群體遺傳學和譜系地理學的分析方法，對以上問題進行了初步的探討和回答。

1 材料與方法

1.1 材料

共采集甘肅、四川、云南及貴州27個居群的261個樣本的葉片材料（表1，圖1， 圖2）， 硅膠干燥后帶回實驗室。

1.2 DNA提取、PCR擴增及測序

依據(jù)CTAB法（Doyle & Doyle， 1987）提取總DNA。對nrDNA 的ITS區(qū)段進行PCR擴增，擴增引物為ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）和ITS5 （GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG） （White et al.， 1990）;對cpDNA的ycf6-psbM和rpl32-trnL區(qū)段進行PCR擴增，擴增引物為ycf6F（ATGGATATAGTAAGT

CTYGCTTGGGC）和psbMR（ATGGAAGTAAATATTCT

YGCATTTATTGCT）（Shaw et al.， 2005）及rpl32F（CAGTTCCAAAAAAACGTACTTC） 和trnLR（CTGCT

TCCTAAGAGCAGCGT） （Shaw et al.， 2007）。ITS 的PCR擴增條件：95 ℃變性2 min;以95 ℃ 30 s，53 ℃ 1 min，65 ℃ 1 min的條件循環(huán)30次;在65 ℃下延伸7 min。ycf6-psbM的PCR反應條件與ITS基本一致，但其退火溫度為52 ℃。 rpl32-trnL 的PCR擴增條件：80 ℃變性2 min;以95 ℃ 1 min， 50 ℃ 1min，65 ℃ 1.5 min的條件循環(huán)33次;在65 ℃下延伸5 min。PCR產(chǎn)物用上海生工生物技術(shù)有限公司的純化試劑盒W5211進行純化，純化產(chǎn)物用ABI3730測序儀進行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測序的原始數(shù)據(jù)用DNAStar 軟件包的Seqman（DNAStar，Inc.，Madison，USA）進行拼接，用Clustal X （Thompson et al.， 1997）進行比對。用PAUP*4.0b10（Swofford，2002）將兩個葉綠體片段的序列進行聯(lián)合。用DnaSP 5.10（Librado & Rozas， 2009）統(tǒng)計單倍型數(shù)目和變異位點特征，以及單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多樣性（π）;利用該軟件進行中性檢驗，包括Tajimas D和Fu and Lis F*檢驗，在居群擴張模型下推測居群大小變化。運用ArcGis10.2編輯各單倍型在地形圖上的地理分布。利用Network5.011 （http：//www.fluxus-engineering.com）構(gòu)建單倍型網(wǎng)狀進化關系。

用Permut（Pons & Petit， 1996）軟件計算居群內(nèi)平均遺傳遺傳多樣性Hs、總的遺傳多樣性Ht和居群間遺傳分化系數(shù)Gst值和Nst值。

應用Arlequin 3.5（Excoffier & Lischer， 2010）軟件包中的分子變異分析（AMOVA），分別檢測該研究物種在居群間和居群內(nèi)的遺傳變異水平。利用該軟件對單倍型分布的Fst進行評價，同時利用該軟件包中的Mantel統(tǒng)計學檢驗，比較地理距離矩陣與平均遺傳距離矩陣之間的相關性，并進行1 000次重復的顯著性檢驗;失配分析（mismatch distribution analysis）由該軟件來完成，即分別計算歧點觀測值與期望值的方差（SSD）、糙度指數(shù)（r： raggedness index）以及它們的顯著性（P value）。

2 結(jié)果與分析

2.1 cpDNA數(shù)據(jù)分析

共有260個樣本的ycf6-psbM和rpl32-trnL同時測序成功，兩個片段聯(lián)合并比對后矩陣長度為1 179 bp。DnaSP 5.10分析共生成11個單倍型，每個居群的核苷酸多樣性（π）、單倍型多樣性（Hd）見表1。物種水平單倍型多態(tài)性指數(shù)（Hd）為0.656，核苷酸多態(tài)性（π）為0.001 61。

單倍型H1主要分布在云南西北部、四川西南部以及甘肅文縣和貴州施秉縣的11個居群中，昆明（居群24）及東川（居群23）有少量分布;單倍型H4則分布在云南中部的5個居群中;H5僅分布在云南昆明的居群24中;H9僅分布在麗江玉龍縣的居群13中;H10僅分布在昆明東川居群22中（圖1，表1）。Network分析表明，發(fā)生頻率最高的單倍型H1和H4位于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的中間位置，單倍型H3、H10、H11、H8、H5、H6和H5位于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的末端位置（圖3）。

居群的 SSD 值以及糙度指數(shù)r 值都為不顯著的正值（P>0.05），中性檢驗表明Tajimas D （-0.59）與 Fu and Lis F（-0.06）值雖然均為負值，但不顯著小于零 （P > 0.05），失配分布曲線為多峰曲線（圖4：左），觀測值背離了期望值，違背了居群擴張模型。這些結(jié)果都表明，異葉澤蘭居群未發(fā)生顯著居群擴張。

異葉澤蘭總遺傳多樣性（Ht）為0.682，居群內(nèi)平均遺傳多樣性（Hs）為0.219，居群間遺傳分化系數(shù)Gst值和Nst 值分別為 0.679和0.655，Nst小于Gst。AMOVA分析結(jié)果表明，異葉澤蘭較多的遺傳變異（65.55%）發(fā)生在居群間， 僅34.45%的變異發(fā)生在居群內(nèi)， 固定指數(shù)Fst=0.655。遺傳距離和地理距離呈正相關，但顯著度不高（r=0.18， P=0.045）。

2.2 ITS分析

共有261個樣本的ITS測序成功，其中197個個體是純合體，其余64個為雜合體。序列比對后的數(shù)據(jù)矩陣長度為638 bp，經(jīng)軟件DnaSP5.10的“phase”功能拆分后生成522條序列。這522條序列共生成21種基因型（H1-H21） （圖2，表1），物種水平基因型多態(tài)性指數(shù)（Hd）為0.686 9，核苷酸多態(tài)性（π）為0.002 35;每個居群的核苷酸多樣性（π）和基因型多樣性（Hd）值見表1。

分布頻率最高的為基因型H1和H3。其中，H1分布在云南中部及四川的冕寧和九龍地區(qū)，云南中部為其主要分布地區(qū);而H3從甘肅文縣沿四川盆地西部邊緣一直分布到分云南西北部地區(qū)，貴州施秉居群中也有分布，其中云南西北部及四川西南部為主要分布區(qū)（圖2，表1）?；蛐虷2分布在居群1、12、13、14、19、24和27中，除甘肅文縣（居群1）外，呈現(xiàn)從云南西北部到云南中部到云南中北部，再到貴州（居群27）的分布格局。H4和H5也呈現(xiàn)出在甘肅文縣（居群1）、云南西北部（居群14）和云南中北部（居群19）的分布式樣。H7僅分布在云南中北部的三個居群中（居群20和21、22），H11僅分布在云南中北部的兩個居群中（居群23和居群25），基因型H8分布在四川西南部（居群16）、云南西北部（居群8、13和15）以及貴州地區(qū)（居群27）。H6為居群14所特有，H10為居群13所特有，H12和H13僅分布在居群2中，H15僅分布在居群1中，H16和H17僅分布在居群17中，H18、H19和H20僅分布在居群18中，H21僅分布在居群27中。因此，ITS基因型主要分布模式可以歸納如下：（1）以H3為代表的“甘肅-川西南-滇西北-貴州”地區(qū)分布類型，以H1為代表的“川西南-滇中” 地區(qū)分布類型;（2）“四川盆地邊緣”特有基因型分布類型，如H12、H13、H15等。出現(xiàn)頻率較高的單倍型H1和H3位于網(wǎng)狀進化圖的中間位置，同時網(wǎng)狀進化圖出現(xiàn)多個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，說明核基因重組事件的發(fā)生（圖5）。

居群的 SSD 值以及糙度指數(shù)r 值都為不顯著的正值（P >0.01）;中性檢驗表明Tajimas D （-1.14）為負值，但它不顯著小于零（P > 0.1），F(xiàn)u and Lis F 為0.64，失配分布曲線為雙峰曲線（圖4：右），觀測值背離了期望值，違背了居群擴張模型。由此推斷，居群未發(fā)生過擴張只是處于動態(tài)平衡，這與葉綠體DNA的分析結(jié)果相一致。

ITS數(shù)據(jù)分析顯示，異葉澤蘭總的遺傳多樣性（Ht）為0.712，居群內(nèi)平均遺傳多樣性（Hs）為0.325，居群間遺傳分化系數(shù)Gst值 為 0.543、Nst 值為 0.370，Nst小于Gst。 AMOVA分析結(jié)果表明，異葉澤蘭58.44%的遺傳變異發(fā)生在居群間， 其余41.56%發(fā)生在居群內(nèi)， 固定指數(shù)Fst=0.584。同時，統(tǒng)計分析顯示，異葉澤蘭遺傳距離和地理距離呈顯著正相關（r=0.43， P=0）。

3 討論

3.1 異葉澤蘭的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)

本研究中，我們對27個居群的261個個體的兩個cpDNA片段及ITS進行了測序和分析，兩個cpDNA片段聯(lián)合分析后共生成11個單倍型， ITS序列經(jīng)PHASE拆分后共生成21個單倍型，表現(xiàn)出較高的單倍型多樣性。在物種水平上，cpDNA的核苷酸多態(tài)性（π）為0.001 61，ITS序列核苷酸多態(tài)性為0.002 35。在菊科植物中，內(nèi)蒙古革苞菊（Tugarinovia mongolica）是菊科一個單種屬植物，包含一變種Tugarinovia mongolica var. ovatifolia，原變種分布在內(nèi)蒙古北部地區(qū)，其卵葉變種分布在內(nèi)蒙古南部?；趦蓚€葉綠體DNA片段（psbA-trnH 和psbK-psbI）的數(shù)據(jù)分析表明，內(nèi)蒙古革苞菊具有非常高的核苷酸多樣性（π=0.009 2）和單倍型多樣性（Hd = 0.908 6），兩個變種之間遺傳分化明顯（Zhao et al.， 2019）。白菊木（Leucomeris decora）為菊科落葉小喬木，其trnQ-rps16， rpl16 和rpl32-trnL聯(lián)合數(shù)據(jù)的核苷酸多態(tài)性為π=0.001 02，而變異率相對較高的核基因片段GAPDH的π=0.002 37（Zhao & Gong， 2012）。鹿蹄橐吾（Ligularia hodgsonii）為中國-日本間斷分布的菊科橐吾屬植物， 在中國主要是圍繞四川盆地分布， 其23個居群的三個葉綠體片段聯(lián)合分析（trnQ-5′rps16， trnL-rpl32和psbA-trnH）的核苷酸多態(tài)性為π=0.002 99，單倍型多態(tài)性為Hd=0.847（Wang et al.， 2013）。因此，與這些菊科植物相比，異葉澤蘭物種水平的核苷酸多態(tài)性和單倍型多態(tài)性都相對較低。但是，在居群水平，ITS數(shù)據(jù)顯示四川盆地邊緣的幾個居群存在相對較高的單倍型多樣性（表1，圖2）。

cpDNA單倍型數(shù)據(jù)顯示，居群水平總的遺傳多樣性（Ht=0.764）大于居群內(nèi)平均遺傳多樣性（Hs=0.250）;ITS數(shù)據(jù)顯示，總的遺傳多樣性（Ht=0.746）大于居群內(nèi)平均遺傳多樣性（Hs=0.382）。AMOVA分析表明，異葉澤蘭居群間遺傳變異高于居群內(nèi) （cpDNA： Fst=0.655; nITS：Fst= 0.584）。Permut分析顯示，居群水平的遺傳分化系數(shù)相對較高（cpDNA：Gst=0.679，Nst=0.655; nITS：Gst=0.543，Nst=0.370）。Petit et al.（2005）統(tǒng)計了124種被子植物的屬于母性遺傳的分子標記遺傳分化系數(shù)Gst平均值和77種被子植物的屬于雙親遺傳的分子標記遺傳分化系數(shù)Gst平均值，結(jié)果顯示屬于母性遺傳的遺傳分化系數(shù)Gst平均值為0.637，屬于雙親遺傳的遺傳分化系數(shù)Gst值平均為0.184，異葉澤蘭分化系數(shù)高于這兩個值。以上結(jié)果顯示，異葉澤蘭居群間存在較明顯的遺傳分化。由于Nst值小于Gst值，因此異葉澤蘭的分布不具有明顯的譜系地理結(jié)構(gòu)（Pons & Petit， 1996）。但是，從單倍型分布式樣來看卻存在較明顯的“甘肅-川西南-滇西北-貴州”和“滇中”兩個相對分離的分布區(qū)，這兩個分布區(qū)都存在各自特有單倍型和主要單倍型。然而，單倍型網(wǎng)狀進化樹顯示，兩個分布區(qū)所擁有的單倍型并沒有各自形成兩大譜系分支，同時兩個分布區(qū)間也存在分布頻率相對較低的共享單倍型。作為一種多年生菊科植物，異葉澤蘭具有較強的適應能力，而種子具有較強的遠距離傳播能力，兩分布區(qū)間應該存在較強的基因交流，這可能是導致異葉澤蘭遺傳多樣性分布式樣的主要原因。

3.2 異葉澤蘭的居群歷史動態(tài)

譜系地理學研究的主要目的之一，是推測第四紀冰期時某物種的避難所及冰后期分布范圍的擴展（Avise， 2000; Liu et al.， 2012）。青藏高原東部及鄰近的中國西南地區(qū)，分布著大量的古老種和新起源種，其中許多植物的分布范圍在冰后期發(fā)生過擴張（Qiu et al.， 2011;Liu et al.， 2012），但也有未發(fā)生過擴張的物種，如偏花報春（Primula secundiflora）（Wang et al.， 2008）。異葉澤蘭作為分布在青藏高原東部和橫斷山脈的物種，中性檢驗和失配分析表明其未發(fā)生過居群的擴張。

冰期時的避難所往往會保留較高的遺傳多樣性和單倍型多樣性， 而單倍型分布能夠反映一個物種的地理分布格局特征 （Hewitt， 1996， 2000;Petit et al.， 2003）。根據(jù)溯祖理論，分布頻率較高的、位于網(wǎng)狀進化樹中間位置的單倍型可能為較古老的單倍型，而居群特有單倍型可能是通過近期輻射分化衍生而來的較年輕的單倍型（Emerson et al.， 2001）。依據(jù)Network分析結(jié)果，異葉澤蘭葉綠體DNA兩個單倍型H1和H4以及ITS兩個單倍型H1和H3分布的地理范圍較廣，且位于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)部位置，可能為古老單倍型（Templeton et al.， 1992; Crandall & Templeton， 1993）。其中，葉綠體DNA單倍型H1和ITS的單倍型H3廣泛分布于甘肅-川西南-滇西北一帶及貴州地區(qū)，而葉綠體DNA單倍型H4和ITS的單倍型H1則分布于云南中部地區(qū)。由此推測，橫斷山區(qū)南部（川西南-滇西北）和云南中部可能是異葉澤蘭在第四紀冰期尤其是末次冰盛期（LGM）時的兩個避難所所在地。

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（責任編輯 蔣巧媛）