QuEChERS-UHPLC-MRM-IDA-EPI法測定牛奶中的喹諾酮類藥物殘留

張鑫，湯學英，崔亞楠，李明陽，雷舒涵，周鑫*

1. 唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心（唐山 063000）；2. 河北省農產品質量安全檢測技術創新中心（唐山 063000）

喹諾酮類藥物（Quinolones）是一類重要的人工合成廣譜抗菌藥[1-2]，這類藥物的作用機制是通過抑制細菌DNA旋轉酶的活性，影響細菌的正常代謝和繁衍，因其良好藥效，被廣泛應用于畜牧養殖等產業中[3]。但這類藥物及其代謝產物可以蓄積在動物體內，形成不同程度的藥物殘留。如果長期食用喹諾酮類藥物殘留超標的牛奶，可能會引起皮疹、過敏等應激反應，影響人體腸道中正常菌群生長；低濃度的殘留藥物也可能誘導致病菌產生耐藥性，潛在危害人體健康[4]。中國從食品安全角度考慮，相繼出臺和頒布相關標準和公告，對禁用的喹諾酮類藥物和食品中的獸藥最大殘留限量提出相關要求[5-6]。

測定牛奶中喹諾酮類藥物殘留的主要方法有酶聯免疫法[7]、蛋白芯片法[8]、液相色譜法[9-10]、液質聯用法[11-12]、化學發光法[1]、免疫層析法[13]等。已報道的方法雖然可對喹諾酮類藥物進行檢測分析，但在方法選擇性和定性能力方面仍存在不足[14]。線性離子阱質譜（Q Trap）與三重四極桿質譜的區別在于其具有多反應監測-信息關聯采集-增強子離子掃描（MRMIDA-EPI）的信息采集模式，MRM掃描的信號強度超過設定閾值時，采集模式將在短時間內自動切換為線性離子阱模式進行增強子離子掃描（EPI），獲得對應MRM通道中超過閾值的目標化合物的高質量二級質譜圖，該掃描模式響應強度高，離子信息豐富，通過與譜庫檢索對比，實現一次進樣完成定性和定量分析[15-19]。

采用QuEChERS方法對牛奶樣品進行前處理，采用超高效液相色譜線性離子阱質譜對喹諾酮類藥物進行分析，建立同時檢測牛奶中16種喹諾酮類藥物殘留的分析方法，為實驗室檢測提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

16種喹諾酮類藥物混合標準品（諾氟沙星、恩諾沙星、環丙沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依諾沙星、洛美沙星、沙拉沙星、萘啶酸、惡喹酸、氟甲喹、達氟沙星、雙氟沙星、司帕沙星、奧比沙星、氟羅沙星混合液標，天津阿爾塔公司）；乙腈、甲酸（色譜純，德國默克公司）；純凈水（杭州娃哈哈公司）。

QuEChERS凈化管（150 mg PLS-A，50 mg PSA，Dikma公司，15 mL ProElut QuEChERS）。

1.2 儀器與設備

液相色譜儀（Shimadzu SIL-30A，日本島津公司）；三重四極桿線性離子阱質譜儀（4000 Q TRAP，美國AB SCIEX公司）；高速離心機（SORVALL LYNX 4000，美國賽默飛公司）。

1.3 前處理方法

取2.0 mL牛奶樣品，加入8.0 mL 0.2%甲酸乙腈，渦旋混合1 min，振蕩提取5 min，超聲提取5 min，以8 000 r/min離心5 min，取上清液待凈化轉移到15 mL QuEChERS凈化管，渦旋混合1 min，8 000 r/min離心5 min，取5.0 mL上清液于40 ℃氮吹至近干，用10%乙腈水溶液定容至1.00 mL，渦旋混勻，過0.22 μm微孔濾膜，上機待分析。

1.4 液相色譜條件

色譜柱采用ACQUITY UPLC BEH C18液相色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司）；流速0.2 mL/min；進樣量5 μL；柱溫35 ℃；流動相A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈。梯度洗脫條件：0～2.0min，A保持在90%；2.0～6.0 min，A由90%下降到5%；6.0～9.0 min，A保持在5%；9.0～9.1 min，A由5%上升到90%；9.1～13.0 min，A保持在90%。

1.5 質譜條件

離子源采用電噴霧（ESI）；檢測方式采用多反應監測-信息關聯掃描-增強子離子掃描（MRM-IDAEPI）；掃描方式采用正離子掃描；離子源溫500 ℃；霧化氣50 psi；輔助氣50 psi；碰撞氣，高；噴霧電壓5 000 V；入口電壓10 V。

增強子離子掃描范圍50～400m/z，掃描速度4 000 Da/s；離子阱碰撞能量35±15 V；喹諾酮類藥物檢測離子對信息、去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）見表1。

表1 喹諾酮類藥物的選擇離子及碰撞能量

2 結果與討論

2.1 液相及質譜方法優化

選擇乙腈和甲醇作為有機相對喹諾酮藥物進行洗脫，比較發現甲醇可提升喹諾酮類藥物分離度；乙腈可使喹諾酮藥物的峰形更好，儀器響應值高，提升檢測靈敏度。由于應用MRM掃描，各目標化合物有各自的離子對信息，故條件優化著重于響應強度因素，使用乙腈作為流動相。選擇喹諾酮類藥物在質譜掃描方式上均為正掃描，母離子為[M+H]+形式，故而在水相流動相選擇上用0.1%甲酸水溶液，以對流動相體系提供游離H+，提高目標化合物容易離子化效率，與此同時優化質譜的電壓、電位、氣流等參數。16種喹諾酮類藥物的色譜圖見圖1。

圖1 16種喹諾酮類藥物多反應監測色譜圖

2.2 線性離子阱定性分析

線性離子阱質譜為離子阱質譜的一種，其三重四極桿結構的Q3有對感興趣的離子捕獲、阱集等功能。增強子離子掃描（EPI）與多反應監測（MRM）的掃描模式通過信息關聯采集（IDA）連接，在MRM掃描的同時獲得目標化合物的特征性二級質譜信息，增強了定性能力。將標準溶液進樣分析，采集到的EPI譜圖（圖2為達氟沙星標液EPI掃描譜圖），編輯入標準譜庫；對檢測樣品進行測定，觸發EPI掃描時，用采集到EPI譜圖進行譜庫檢索。結合保留時間和離子豐度比，疑似陽性樣品二級質譜圖與譜庫中標準譜圖進行相似度比對，擬定purity數值大于70%時，疑似陽性樣品為目標化合物的檢出[20]。

圖2 達氟沙星的增強子離子掃描質譜圖

2.3 方法線性范圍及定量限

采用外標法對牛奶中的喹諾酮類藥物進行定量分析。用空白牛奶基質溶液配制不同梯度濃度的標液，上機進行測定，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標擬合繪制標準曲線。結果表明，在2～100 ng/mL線性范圍內，各喹諾酮類藥物線性方程的相關系數均大于0.99，呈現出良好線性關系。方法設定S/N＞10為定量限，確定方法定量限為0.5～2 μg/L，結果見表2。

表2 喹諾酮類藥物線性方程相關系數、定量限以及方法回收率、精密度

2.4 回收率和精密度

取空白牛奶樣品，分別選擇2，10和50 μg/L這3種質量濃度對其進行16種喹諾酮標準品添加，進行定量分析，計算添加回收率和精密度（n=6），結果見表2。

3 結論

應用QuECHERS-UHPLC-MRM-IDA-EPI方法對牛奶中16種喹諾酮類藥物殘留進行測定分析。方法操作安全、簡便、高效，且準確性、重復性好，在MRM掃描模式保證定量準確的同時，利用線性離子阱的阱集功能，高響應強度的EPI二級質譜圖和標準譜庫的對比加強對喹諾酮類藥物的定性功能，降低喹諾酮類藥物殘留檢測時出現假陽性的概率。