溶劑結晶法提取蕨菜葉芽中的植物甾醇

劉美琴，趙玉梅，龐惠文，喬建芬，張鑫

1. 山西鐵道職業技術學院（太原 030013）；2. 山西安泰集團（介休 032000）

蕨菜又名如意菜、貓爪子菜、拳頭菜，營養成分豐富，粗蛋白和粗纖維含量較高，素有“山菜之王”的美譽，廣泛分布于我國海拔500～1 700 m區間的地區[1-2]。蕨菜富含18種氨基酸，其中10種為人體必需氨基酸[3]。蕨菜的幼嫩葉芽中含有豐富天然甾體類物質，如β-谷固醇、豆甾烯-3, 6-二酮、那坡甾酮A等[4]，兼具食用價值和藥用價值。植物類甾醇具有降低人體膽固醇和預防心腦血管疾病的功效[5]，被國際營養學會推薦為人類未來十大功能性營養成分之一，現已被廣泛應用于醫藥、化工、食品等領域，其中尤為重要的是在臨床醫學中，將植物甾醇代替膽固醇應用于藥物脂質體制備[6-7]。植物類甾醇對皮膚有很高的滲透性，能保持皮膚水分，促進新陳代謝，抑制皮膚炎癥，可作為W/O乳化劑用于化妝品配方生產。試驗以山西產蕨菜為原料，采用溶劑提取-結晶法提取甾醇類物質，并對影響甾醇提取量和品質的因素進行了研究。

1 試驗部分

1.1 試驗中的材料、試劑和儀器

蕨菜，東港市惠源食品有限公司；乙酸乙酯，河南西伯化工產品有限公司；正己烷，常州市中超化工有限公司；乙醇，濟南創世化工有限公司。

SHZ-D實驗室抽濾機，濟寧程煤工礦設備有限公司；DZF-621013真空干燥箱，江蘇安盈環境設備有限公司；LWL臥式高速離心機，張家港市越豐化工機械有限公司；HWFT低溫恒溫箱，蘇州菲唐檢測設備有限公司；GC-MS3100型氣相質譜聯用儀，廈門和頌電子科技有限公司；DSRII動態剪切流變儀，上海勞瑞儀器設備有限公司；DR-A1數顯阿貝折光儀，泉州天美化工儀器有限公司；DSC7020差示掃描量熱儀，上海熱冰電子科技有限公司。

1.2 試驗方法[8-9]

摘取新鮮蕨菜的嫩綠葉芽，剪碎并粗研磨后倒入足量的乙酸乙酯溶液中，充分浸提6 h后抽濾除去濾渣得到黃綠色濾液。真空濃縮黃綠色濾液得到初步提取的粗提取液。粗提取液高速離心后立即分離出上清液，加入適量的正己烷促進甾醇結晶，結晶時間6 h。濾去溶劑后烘干結晶產物至恒重，再加入足量熱乙醇溶液后進行兩次重結晶操作，此時得到的結晶物為純度較高的植物甾醇混合物。將結晶物加入少量的乙酸乙酯溶劑，冷藏于冰柜中備用。

1.3 試驗中的相關測定

GC-MS試驗條件：進樣量1.0 μL，氮氣載氣流速2.0 mL/min，色譜柱HP-10MS（10%甲基聚硅氧烷+90%二甲基苯；25 m×0.5 m mid，0.25 μm薄膜），進樣口溫度220 ℃，柱溫起始溫度100 ℃，以10 ℃/min速率升溫到280 ℃；DSC分析：采用DSC7020差示掃描量熱儀測定甾醇的吸熱曲線，掃描溫度范圍20～250℃，升溫速率5 ℃/min，氮氣流量20 mL/min；表觀黏度的測定[10]：采用動態流變儀測定甾醇表觀黏度，樣品0.1 g，錐板夾具直徑50 mm，錐角2°5’±2’，剪切率從0.1 s-1到100 s-1。

甾醇含量的測定[11]：用無水乙醇溶解0.1 g結晶樣品并定容至25 mL容量瓶。取出5.0 mL溶液后加入2.0 mL磷硫鐵顯色劑，混勻后靜置30 min，在525 nm波長處測其吸光度來計算甾醇含量，如式（1）所示。

式中：m為樣品所測吸光度所對應的甾醇量，μg/mL；V為定容體積，mL；B為稀釋倍數；M為樣品質量，μg。

2 結果與討論

2.1 GC-MS分析

提取液的GC-MS分析圖譜如圖1所示。主要出峰時間集中在18～28 min之間。按照出峰順序，9個出峰位置依次分別為豆甾烯-3, 6-二酮、1-二十八烷醇、1-二十一烷醇、1-二十二碳烯、β-谷甾醇、豆甾醇、草油甾醇、牛膝甾酮、那坡甾酮A。以檢出峰總面積為100%來計，β-谷甾醇含量最大（46.18%），其次為豆甾烯-3, 6-二酮（11.86%）、草油甾醇（10.83%）、那坡甾酮A（9.17%）、豆甾醇（8.25%）。可以明顯地看出植物甾醇總含量超過85%，說明試驗提取方案切實可行，試驗效果良好。

圖1 提取液的GC-MS分析圖譜

2.2 DSC分析

DSC圖譜中的玻璃化轉變溫度與聚合物的基本性能有著緊密的聯系。試驗提取的甾醇的DSC曲線如圖2所示。結果顯示甾醇有兩個玻璃化轉變溫度（軟段玻璃化轉變溫度和硬段玻璃化轉變溫度）。甾醇混合物中分子的軟硬段結構發生了一定程度的微相分離。軟段玻璃化轉變溫度為78.86 ℃，硬段玻璃化轉變溫度為237.15 ℃，在溫度低于200 ℃的情況下硬段結構的分子運動范圍有限，與軟段結構分子之間的接觸混合概率較小，從而實現軟硬段分子的微相分離，表觀上表現為兩種玻璃化轉變溫度相差較大。

圖2 甾醇的DSC分析圖譜

2.3 不同料液質量比對植物甾醇提取量的影響

不同的原料與乙酸乙酯質量比（料液質量比）對蕨菜中甾醇類物質的提取量柱形圖如圖3所示。固定其他提取條件不變，料液質量比分別為1：1，1：3，1：5，1：7和1：10，測定甾醇提取量。甾醇類物質的提取量隨著乙酸乙酯用量的增大而顯著升高，當料液質量比達到1：7時，甾醇提取量達到最大（97 mg/g）；之后增大乙酸乙酯用量，提取效果不甚理想。根據傳質規律，若提取溶劑達到一定量時，提取帶來的正面效果不及甾醇濃度被溶劑稀釋所帶來的負面效應，因而料液質量比達到1：10時，甾醇提取量反而略有下降。因此，植物甾醇類物質被提取的料液質量比最佳為1：7。

圖3 不同料液質量比條件下對應的甾醇提取量

2.4 結晶過程對甾醇混合物的影響

2.4.1 結晶溫度對植物甾醇總含量的影響

考察不同結晶溫度（-20，-15，-10，-5，0和5℃）對甾醇混合物含量的影響，從而確定試驗中的最佳結晶溫度。由圖4可知，在低溫條件下正己烷易與甾醇混合物共同結晶析出，使甾醇總含量較低。而當結晶溫度超過0 ℃時，結晶效果不明顯，試驗效果不理想。綜合來講，結晶溫度應控制在（-10±2）℃范圍內為宜。

2.4.2 結晶時間對植物甾醇總含量的影響

考察不同結晶時間（2，4，6，8，10和12 h）對甾醇混合物含量的影響，固定其他試驗條件不變，優選試驗中的最佳結晶時間。如圖5所示，結晶時間越長，甾醇混合物從溶劑中脫離后結晶的可能性越大，純度越高，考慮到試驗效率和結晶時間過長導致甾醇活性下降，結晶時間選擇6 h。

圖4 結晶溫度對甾醇總含量的影響關系曲線

圖5 結晶時間對甾醇總含量的影響關系曲線

2.4.3 重結晶對植物甾醇總量的影響

試驗考察重結晶次數對于最終植物甾醇提取質量的影響關系，結果如表1所示。隨著重結晶次數的增加，甾醇的純度固然可以隨重結晶次數的增大而提升，但同時實驗操作的頻繁性會使得甾醇提取物的流失量隨之增加，使得提取總量下降。植物甾醇純度達到90%即可滿足試驗需求，故確定試驗重結晶次數為2次。

表1 重結晶次數對植物甾醇總量的影響變化

2.5 植物甾醇混合物在加熱過程中的表觀黏度和折光系數

表觀黏度與甾醇的濃度呈正相關聯系，而折光系數在一些情況下也會與表觀黏度的變化趨勢相同。試驗提取的植物類甾醇混合物在加熱溫度分別為120和180 ℃條件下的表觀黏度和折光系數變化值如表2所示。當加熱溫度為120 ℃時，表觀黏度與折光系數均在一個較小的范圍內波動，沒有很直觀的變化趨勢，整體而言表觀黏度和折光系數隨加熱時間的延長而小幅增大。但當加熱溫度為180 ℃時，甾醇分子之間可能發生聚合反應，形成C—C、C—O—C等連接結構的高分子聚合物，同時一些甾酮結構的小分子由于熱穩定性較差，會發生結構異變或分解成單元結構更小的分子，整個甾醇混合物的分子結構與原先發生了較大變化，表現在表觀黏度和折光系數上，可以明顯地觀察到二者隨著加熱時間的延長而顯著增大。

表2 植物甾醇混合物的表觀黏度和折光系數變化

3 結論

以摘取蕨菜嫩綠葉芽為原料，采用溶劑提取-結晶-重結晶的工藝流程提取其中的甾醇類物質。GC-MS分析結果顯示，提取物主要組成成分為β-谷甾醇（46.18%）、豆甾烯-3, 6-二酮（11.86%）、草油甾醇（10.83%）、那坡甾酮A（9.17%）、豆甾醇（8.25%），植物甾醇總含量超過85%。DSC的分析則表現出軟硬段分子的微相分離，形成軟段玻璃化轉變溫度（78.86 ℃）和硬段玻璃化轉變溫度（237.15℃）的兩個吸熱峰。料液質量比、結晶溫度和結晶時間會對提取的植物甾醇總含量產生顯著影響，經分析探討確定，當料液質量比為1：7，結晶溫度控制在（-10±2）℃，結晶時間為6 h時試驗效果最佳。重結晶次數會對甾醇提取總量產生明顯影響，考慮到實驗頻繁性會減少甾醇提取物的質量，純度達到90%即可滿足需求，確定重結晶次數為2次。試驗還研究了在加熱過程中甾醇提取物的表觀黏度和折光系數所產生的變化，當加熱溫度為120 ℃時，2種性能參數在一個較小范圍內波動；當加熱溫度為180℃時，甾醇提取物的分子結構發生較大變化，表現在表觀黏度和折光系數上，二者隨著加熱時間的延長而明顯增大。綜上所述，提取蕨菜中甾醇的試驗方法切實可行，提取物的純度和質量均能達到使用需求，提取物的熱穩定性良好，試驗效果較為理想。