乙醇沉淀法純化甜菊糖苷工藝條件優化

王保平，童紅梅*，宋巧

甘肅醫學院（平涼 744000）

甜葉菊（Stevia rebaudiana（Bertoni）Hemsl）為一種富含甜菊糖苷的菊科植物[1-2]。甜菊糖苷在國際上被譽為“第三糖源”，其甜度約為蔗糖的300倍，熱量僅為蔗糖的1/300，是高甜度、低熱量的天然甜味劑[3]。甜菊糖苷能使減肥人士、糖尿病患者、高血壓患者等忌糖人群擺脫無糖之苦，在第7次國際糖尿病會議上，甜菊糖苷被公認為糖尿病和高血壓患者的理想甜味劑[4]。通過大量臨床試驗，甜菊糖苷安全無毒性得到認證。此外，甜菊糖苷還有降血糖、降血脂、防齲齒、抗腫瘤、利尿等藥用價值。甜菊糖苷的價值受到重視，市場需求大，被廣泛應用在食品、飲料、醫藥、日?；さ阮I域[5]。

甜葉菊中甜菊糖苷約有9種成分，其純化測定極其復雜。常見的純化方法有沉淀法、吸附法和膜分離技術[4-6]。沉淀法中，醇沉法相對化學絮凝法損失率低，不會引入其他雜質和無機離子且過程簡單，但提取的甜菊糖苷純度低且顏色深[7]。

試驗以甘肅酒泉產的甜葉菊為材料，通過超聲提取甜菊糖苷粗提樣品，用乙醇沉淀、酸性氧化鋁吸附、微孔過濾器膜過濾3種方法協同作用去除樣品中雜質，探究甜菊糖苷純化條件優化對甜菊糖苷得率的影響，以得到純度較高的甜菊糖苷樣品，解決生產中甜菊糖苷提取樣品純度低顏色深的問題。

1 材料與方法

1.1 樣品

甜葉菊（購自甘肅省酒泉市肅州區農貿市場，通過肅州區農業局農技科人員鑒別。冷藏于0 ℃的冰箱中備用）。

1.2 儀器與設備

中藥超聲提取機（JBT/C-YCL500T/3P，山東金百特）；Heidolp旋轉蒸發儀（德國）；微孔過濾器天津雙吉實驗材料經營部）；紫外分光光度計（UV-1780）；101-2型數顯電熱恒溫鼓風干燥箱（上海錦屏儀器儀表有限公司）；JP-1500B高速多功能粉碎機（永康市久品工貿有限公司）；HZK-JA 210電子天平（福州華志科學儀器有限公司）；SHHW600三用電熱恒溫水箱水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.3 試劑

無水乙醇、氧化鋁、蒽酮、濃硫酸（均為分析純）；甜菊糖苷標準品（STV，純度＞99.0%，日本和光純藥工業株式會社）。

1.4 方法

1.4.1 甜菊葉預處理將甜葉菊干葉去雜去屑，水洗烘干（40 ℃、60 h）后粉碎粒度0.150～0.180 mm，干燥備用。

1.4.2 甜菊糖苷提取

取1 g冷凍干燥樣品，液氮中充分研磨后按加入50%，60%，70%，80%和90%乙醇（料液比1︰50 g/mL），充分混勻后在功率200 W、60 ℃下超聲處理40min，反復提取3次，合并濾液，旋轉蒸干，對應乙醇體積分數定容后離心去掉沉淀，微孔過濾器膜過濾，取濾液得到粗提液。用蒽酮比色法進行定量分析，采用紫外分光光度計檢測甜菊糖苷，按式（1）計算甜菊糖苷提取率。

1.5 結果計算

1.5.1 甜菊糖苷提取率、純度計算

稱取10 g甜葉菊冷凍鮮樣，樣品提取方法同1.4.2小節，合并濾液并真空濃縮，干燥得粗甜菊糖苷浸膏。取2～3 g粗甜菊糖苷浸膏，置于25 mL容量瓶中，用不同體積分數乙醇超聲溶解并定容至刻度線。按照標準曲線的制作方法在最大吸收波長621 nm處測定吸光度，按式（2）計算甜菊糖苷提取率。

式中：X為甜菊糖苷浸膏提取率，%；m1為甜菊糖苷浸膏質量，g；m2為甜葉菊葉質量，g。

式中：Y為甜菊糖苷提取率，%；C為樣品甜菊糖苷質量濃度，mg/mL；m3為測得率時稱取的粗甜菊糖苷浸膏質量，g；V為樣品的體積，25 mL。

式中：Z為甜菊糖苷純度，%；Y為甜菊糖苷提取率，%；m2為甜葉菊葉質量，g；m3為測得率時稱取的粗甜菊糖苷浸膏質量，g。

1.5.2 甜菊糖苷標準曲線繪制

精準稱取甜菊糖苷標準品，配制成0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70和0.80 mg甜菊糖苷標準品溶液，置于10 mL容量瓶中，用80%乙醇溶液定容，渦旋混勻后加0.30 mL 1.5%蒽酮溶液、2.00 mL濃硫酸，于80 ℃恒溫水浴鍋中顯色15 min（蒽酮比色法），在621 nm波長處分別測定各反應體系的吸光度。以甜菊糖苷質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線如圖1。線性回歸方程為y=0.939 8x+0.199 1，相關系數r2=0.998 3。

2 結果與分析

2.1 乙醇體積分數對甜菊糖苷提取率的影響

按照1.4.2甜菊糖苷提取方法制備粗提液，溶于70%乙醇（料液比1︰20 g/mL），充分混勻后以超聲功率200 W、提取溫度75 ℃超聲處理40 min，于80 ℃回流提取1 h，加入1︰5（g/mL）酸性氧化鋁，于40 r/min室溫振蕩60 min，澄清后取上清液，0.3 μm微孔膜過濾。計算甜菊糖苷的提取率與純度。結果見表1。

圖1 甜菊糖苷標準曲線

表1 乙醇體積分數對甜菊糖苷提取率的影響

從表1可以看出，在超聲提取條件相同的前提下，選用酸性氧化鋁作為吸附劑，振蕩吸附60 min，70%乙醇甜菊糖苷的提取率最高，可達26.35%；繼續提高乙醇體積分數，甜菊糖苷提取率不但沒有升高，反而在下降。由此可知，70%乙醇是提取甜菊糖苷的最佳體積分數。

2.2 料液比對甜菊糖苷提取率的影響

按照1.4.2甜菊糖苷提取方法制備粗提液，用70%乙醇按照料液比1︰20，1︰30，1︰40，1︰50和1︰60（g/mL）加入，充分混勻后以超聲功率200 W、提取溫度75 ℃超聲處理40 min，于80 ℃回流提取1 h，加入1︰5（g/mL）酸性氧化鋁，在40 r/min室溫振蕩60 min，澄清后取上清液，經微孔過濾器膜過濾，用蒽酮比色法進行定量分析，采用紫外分光光度計檢測甜菊糖苷，計算甜菊糖苷的提取率與純度。結果見表2。

表2 料液比對甜菊糖苷提取率的影響

由表2可知，在超聲提取條件相同前提下，選用酸性氧化鋁作為吸附劑（1︰5 g/mL），振蕩吸附60 min，70%乙醇提取甜菊糖苷，選用不同液料比，以料液比1︰40（g/mL）時提取率最高，甜菊糖苷提取率可達26.38%，過大或過小的料液比均不能提高甜菊糖苷的提取率。

2.3 超聲功率對甜菊糖苷提取率的影響

準確稱取4份1.000 g甜葉菊凍干粗粉，70%乙醇料液比1︰40（g/mL），超聲時間60 min，提取溫度75℃，分別在超聲功率100，150，200，250和300 W下進行超聲提取，經微孔過濾器膜過濾抽濾，濾液定容至100.00 mL，移取5.00 mL稀釋至100.00 mL，計算甜菊糖苷的提取率與純度。結果見表3。

表3 超聲功率對甜菊糖苷提取率的影響

由表3可知，70%乙醇提取甜菊糖苷，料液比1︰40（g/mL），選用酸性氧化鋁作為吸附劑（1︰5 g/mL），振蕩吸附60 min，選用不同超聲功率，以超聲功率200 W時甜菊糖苷提取率最高，可達26.79%，過大或過小的超聲功率均不能提高甜菊糖苷提取率。

2.4 提取溫度對甜菊糖苷提取率的影響

準確稱取6份1.000 g甜葉菊凍干粗粉，用70%乙醇提取，料液比1︰40（g/mL），超聲時間40 min，超聲功率200 W，分別在提取溫度35，45，55，65和75 ℃下進行超聲提取，經微孔過濾器膜過濾抽濾，濾液定容至100.00 mL，移取5.00 mL稀釋至100.00 mL，計算甜菊糖苷提取率與純度。結果見表4。

表4 提取溫度對甜菊糖苷提取率的影響

由表4可知，用70%乙醇提取甜菊糖苷，料液比1︰40（g/mL），選用酸性氧化鋁作為吸附劑（1︰5 g/mL），振蕩吸附60 min，超聲功率300 W，選用不同提取溫度，提取溫度65 ℃時甜菊糖苷提取率最高，可達26.57%，過高或過低的提取溫度均不能提高甜菊糖苷提取率。

2.5 乙醇沉淀法提取甜菊糖苷重復試驗

準確稱取3份1.000 g冷凍干樣品，液氮中充分研磨后按料液比1︰50（g/mL）加入70%乙醇，充分混勻后超聲功率200 W、提取溫度60 ℃處理40 min，重復提取3次，將濾液旋轉蒸干，用70%乙醇定容后離心去掉沉淀，取濾液得到粗提液，溶于70%乙醇（料液比1︰20 g/mL），充分混勻后以超聲功率200 W、提取溫度65 ℃超聲處理40 min，于80 ℃回流提取1 h，加入1︰5（g/mL）酸性氧化鋁，在40 r/min室溫振蕩60 min，澄清后取上清液，經微孔過濾器膜過濾，濾液用蒽酮比色法進行定量分析，采用紫外分光光度計檢測甜菊糖苷，計算甜菊糖苷提取率和純度。結果見表5。

表5 乙醇沉淀法對甜菊糖苷提取純度的影響

由表5可知，用70%乙醇提取甜菊糖苷，料液比1︰40（g/mL），選用酸性氧化鋁作為吸附劑（1︰5 g/mL），振蕩吸附60 min，超聲功率200 W，提取溫度65 ℃，經微孔過濾器膜過濾，甜菊糖苷提取率均值可達28.81%，甜菊糖苷純度均值為88.63%。同參考資料相比，甜菊糖苷提取率和純度均有所提高。

3 結論與討論

采用乙醇沉淀法提取甜菊糖苷，主要是甜菊糖苷易溶于乙醇，而蛋白質、纖維素等生物大分子不溶于乙醇，從而達到除雜目的；加之乙醇可回收循環利用，降低成本，便于工業生產大規模推廣應用。結果表明，利用70%乙醇提取甜菊糖苷，以料液比1︰40（g/mL），選用酸性氧化鋁作為吸附劑（1︰5 g/mL），振蕩吸附60 min，超聲功率200 W，提取溫度65 ℃，經0.30 mm微孔過濾器膜過濾，可得甜菊糖苷提取率為28.81%，甜菊糖苷純度為88.63%，樣品顏色潔白，后味不苦[8]。但與商品甜菊糖苷相比（純度96%以上）還有差距[9-10]，有待進一步優化純化條件。