高壓脈沖電場法提取黑果腺肋花楸中花色苷的工藝

劉子豪，趙權

1. 吉林農業大學中藥學院（長春 130118）；2. 吉林農業科技學院中藥學院（吉林 132101）

黑果腺肋花楸（Aronia prunifoliaViking）為薔薇科腺肋花楸屬一種多年生落葉灌木的果實[1]，其多酚類物質花色苷的含量最高[2]。現有研究結果表明，黑果腺肋花揪及其提取物不僅可以抑制炎癥、降低血糖、血脂，而且其抗氧化能力更強[3-5]。正因花色苷在免疫調節、預防代謝類疾病以及抗氧化保健等方面具有顯著的效果[6-10]，所以得到了工業生產領域的廣泛關注。近年，黑果腺肋花楸還被列入新食品原料目錄[11]，目前多以食品、飲品、保健品等市場產品為主[12-13]。黑果腺肋花楸的果實中花色苷含量豐富，但由于花色苷性質不穩定，見光受熱易分解，在提取花色苷成分的過程中往往提取量偏低，造成了資源的浪費。進一步提高花色苷的提取率成為新的研究趨勢。

高壓脈沖電場（high voltage pulsed electric field，PEF）的提取原理是利用高壓電流擊穿樣品的細胞膜或者細胞壁，使其有效成分從細胞里溶出而更易于被提取，此方法最早應用于食品殺菌領域[14]。由于PEF具有快速、高效、節能、產熱少等特點，在成分提取領域也有著廣泛的應用[15-16]。目前，黑果腺肋花楸花色苷的提取方法常見有溶劑浸提法、超聲波輔助提取法等，但PEF在黑果腺肋花楸花色苷工業提取方面的研究較少。

試驗采用高壓脈沖電場提取方法提取黑果腺肋花楸果實中的花色苷，以花色苷提取量為考察指標，通過探究各個因素對花色苷提取效果的影響并用Box-Behnken試驗進行設計優化，從而獲得最佳提取條件，旨在為日后的現代研究提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黑果腺肋花楸果實：吉林市大綏河黑果腺肋花楸種植基地。

矢車菊素-3-葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside）、矢車菊素-3-半乳糖（cyanidin-3-galactoside）和矢車菊素-3-阿拉伯糖苷（cyaniding-3-arabinoside）標準品，Sigma公司；無水乙醇、甲醇均為分析純，乙腈為色譜純，Fisher公司；純凈水，娃哈哈。

1.2 試驗方法

取新鮮完好的黑果腺肋花楸果實，冷水沖洗干凈，冷風干燥后充分打碎勻漿，準確稱取2.00 g果漿置于干凈的具塞瓶中，按不同比例加50%乙醇，在固定溫度下水浴加熱，旋轉真空抽濾，定容后參照徐貝貝[17]的HPLC條件檢測其花色苷含量。

1.2.2 單因素試驗

1.2.2.1 電場強度對花色苷提取效果的影響

設定電場強度10，15，20，25和30 kV·cm-1，溫度為25 ℃，料液比為1：30 g·mL-1，乙醇體積分數為60%進行提取，提取液旋轉真空濃縮備用，按1.2.1色譜條件進行HPLC分析計算黑果腺肋花楸中的花色苷提取量，平行測定3次，確定最佳電場強度。

1.2.2.2 溫度對花色苷提取效果的影響

按1.2.2.1確定的最佳電場強度，設定溫度25，30，35，40和45 ℃，料液比為1：30 g·mL-1，乙醇體積分數為60%進行提取，提取液旋轉真空濃縮備用，按1.2.1色譜條件進行HPLC分析計算黑果腺肋花楸種的花色苷提取量，平行測定3次，確定最佳提取溫度。

1.2.2.3 料液比對花色苷提取效果的影響

按1.2.2.1確定的最佳電場強度，按1.2.2.2確定最優提取溫度，設定料液比為1：20，1：30，1：40，1：50和1：60 g·mL-1，乙醇體積分數為60%進行提取，提取液旋轉真空濃縮備用，按1.2.1色譜條件進行HPLC分析計算黑果腺肋花楸中的花色苷提取量，平行測定3次，確定最佳料液比。

要想是混合式學習方法的效果可以更加充分的發揮，教師必須要改變以往的教學理念，通過自我學習等方法充分認識到混合式學習方法的重要性與作用，養成開放性思想，推動該學習方法的落實與應用。同時學校也通過定期組織教師參加相關內容的講座、到其他學校進行參觀、定期對教師進行教育培訓等方法提高教師對混合式學習方法的認識程度與相關專業知識的學習，進而改變教師以往的教學理念，使教師更加積極的進行混合式學習的教學。

1.2.2.4 乙醇體積分數對花色苷提取效果的影響

按1.2.2.1確定的最佳電場強度，按1.2.2.2確定最優提取溫度，按1.2.2.3確定的最佳料液比，設定乙醇體積分數為40%，50%，60%，70%和80%進行提取，提取液旋轉真空濃縮備用，按1.2.1色譜條件進行HPLC分析計算黑果腺肋花楸中的花色苷提取量，平行測定3次，確定最佳乙醇體積分數。

1.2.3 Box-Behnken試驗

在單因素對提取效果影響的試驗結果基礎之上，通過Design-Expert 8.0.6.1軟件建立以4個因素（料液比（A）、電場強度（B）、溫度（C）、乙醇體積分數（D））為自變量，花色苷提取量（Y）為響應值的3水平的Box-Behnken試驗設計，通過響應面分析的結果確定最優工藝條件。相關因素水平及編碼的設計見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計的因素和水平

2 結果與分析

2.1 花色苷色譜分析

由圖1的出峰時間得知，1號峰為矢車菊素-3-半乳糖苷；2號峰為矢車菊素-3-葡萄糖苷；3號峰為矢車菊素-3-阿拉伯糖苷。矢車菊素-3-半乳糖苷的標準方程為Y=17 332.62X+114 270.8（R2=0.999 9）；矢車菊素-3-葡萄糖苷的標準方程為Y=14 169.4X+68 199.53（R2=0.999 9）；矢車菊素-3-阿拉伯糖苷的標準方程為Y=29 482.8X+85 457.36（R2=0. 999 8）。

圖1 標準品及樣品色譜圖

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 電場強度對黑果腺肋花楸花色苷提取效果的影響

由圖2可見，電場強度在10～25 kV·cm-1之間時，花色苷的提取量隨電場強度的升高而逐漸增加。這是由于增大電場強度，細胞壁受到電場破壞，使在細胞中的花色苷更易溶出。當電場強度為25 kV·cm-1時，花色苷提取量達到最大值。繼續加大電場強度，花色苷的提取量降低，這可能是由于電場強度過大，致使花色苷降解。因此，最佳的電場強度為25 kV·cm-1，花色苷提取量為8.62 mg·g-1。

2.2.2 溫度對黑果腺肋花楸花色苷提取效果的影響

由圖3可見，溫度在25～35 ℃之間時，花色苷的提取量隨溫度的升高而逐漸增加。這是由于在一定溫度下，隨著溫度的升高，花色苷在溶劑中的溶解度也逐漸增大，變得更易溶出。當溫度為35 ℃時花色苷提取量達到最大值。繼續升高溫度，會促使花色苷降解和被破壞，導致花色苷提取量下降。因此，最佳的溫度為35 ℃，花色苷提取量為8.67 mg·g-1。

2.2.3 料液比對黑果腺肋花楸花色苷提取效果的影響

由圖4可見，料液比在1：20～1：50 g·mL-1之間時，花色苷的提取量隨料液比的增加而逐漸升高。這是因為當增大溶劑的用量時，樣品與溶劑充分接觸，花色苷溶出較多，提取量增加。在料液比為1：50g·mL-1時花色苷提取量達到最大值。繼續加大料液比，花色苷提取量開始降低，這可能是由于樣品已經與溶劑充分接觸后完全溶出，且隨著溶劑的增多，樣液濃度降低。因此，最佳的料液比為1：50 g·mL-1，花色苷提取量為8.78 mg·g-1。

圖2 電場強度對黑果腺肋花楸花色苷提取效果的影響

圖3 溫度對黑果腺肋花楸花色苷提取效果的影響

圖4 料液比對黑果腺肋花楸花色苷提取效果的影響

2.2.4 乙醇體積分數對黑果腺肋花楸花色苷提取效果的影響

由圖5可知，乙醇體積分數在40%～70%之間時，花色苷的提取量隨乙醇體積分數的增大而逐漸增加。這是因為當增大乙醇體積分數時，樣品與溶劑充分接觸，花色苷溶出量增多。在乙醇體積分數為70%時花色苷的提取量達到最大值。繼續增大乙醇體積分數，花色苷的提取量降低，這可能是易溶于乙醇的雜質成分溶出量增加導致花色苷的提取量下降。因此，最佳的乙醇體積分數為70%，花色苷提取量為8.72 mg·g-1。

圖5 乙醇體積分數對黑果腺肋花楸花色苷提取效果的影響

2.3 Box-Behnken試驗及試驗結果

2.3.1 Box-Behnken試驗結果分析

Box-Behnken試驗設計與結果見表2。

表2 響應面試驗方案及結果

根據表2試驗數據，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件進行二次方程回歸擬合，得出方程：Y=8.79+0.32A+0.43B+0.055C-0.18D+0.29AB-0.12AC+0.37AD-0.48BC-0.18BD+0.27CD-0.94A2-0.89B2-0.52C2-0.51D2。

由表3方差分析的結果可知：當以黑果腺肋花楸花色苷的提取量為響應值時，模型p＜0.000 1，說明模型極具有顯著性，影響花色苷提取量的順序為B（電場強度）＞A（料液比）＞D（乙醇體積分數）＞C（溫度），其中因素A、B具有極顯著性（p＜0.01），A2、B2、C2、D2極具有顯著性（p＜0.01），失擬項p=0.113 9＞0.05不具有顯著性，表明試驗誤差小，其結果也與模型擬合良好，可以用來分析和預測試驗結果?；貧w方程相關系數R2=0.958 1，能夠較準確地預測實際情況。

2.3.2 響應面分析

圖6為A（料液比）、B（電場強度）、C（溫度）、D（乙醇體積分數）各因素之間兩兩交互對3種花色苷提取量的影響的三維響應面曲線圖。由圖6可見，各因素交互作用顯著，A、B因素對花色苷提取量的影響具有顯著性。綜合圖6及表3可以得出，模型中的一次項A、B有極顯著性（p＜0.01）；AB、AC、BD、CD交互項（p＞0.05）都不明顯；二次項A2、B2、C2、D2（p＜0.01）極其顯著。表明各因素對花色苷提取效果的影響非簡單的線性關系。

表3 回歸方程方差分析

2.3.3 驗證性試驗

應用Design-Expert 8.0.6.1軟件對影響黑果腺肋花楸花色苷提取量的綜合分析，得到高壓脈沖電場提取黑果腺肋花楸花色苷提取量的最佳工藝為電場強度21.72 kV·cm-1、溫度34.09 ℃、料液比1：51.88g·mL-1、乙醇體積分數67.85%，為了便于實際操作，故將工藝條件修正為電場強度25 kV·cm-1、溫度35 ℃、料液比1：50 g·mL-1、乙醇體積分數70%，以此條件進行花色苷的提取，其提取量為8.79 mg·g-1，與預測值基本相符，說明了該模型結果的準確性與工藝條件的實用性。

2.4 不同提取方法對花色苷提取量的分析比較

3種花色苷單體的總含量約為總花色苷含量[18]。如圖7可知，同溶劑提取法和超聲波輔助提取法提取花色苷的試驗結果進行比較[19-20]，高壓脈沖提取法提取花色苷的量最多。

圖7 不同提取工藝下花色苷提取量的比較分析

4 結論與討論

研究通過響應面分析方法結合高壓脈沖電場提取方法提取黑果腺肋花楸果實中的花色苷，得到黑果腺肋花楸花色苷高壓脈沖提取法的最佳工藝條件為電場強度25 kV·cm-1、料液比1：50 g·mL-1、溫度35℃、乙醇體積分數70%。在此條件下，花色苷的提取量為8.79 mg·g-1。經計算，PEF的花色苷提取量比其他兩種常用提取方法各提高36.70%和9.87%。與此同時，高壓脈沖提取方法不僅原材料耗費更少、溫度更低、提取速度更快，而且更適合性質不穩定，見光受熱易分解等物質的提取。