糖基化改性大豆蛋白溶解特性

盧亞東，梁亞萍，王愈，陳振家

1. 山西農業大學食品科學與工程學院（晉中 030801）；2. 山西農業大學校醫院（晉中 030801）

大豆中蛋白質含量較高而且營養豐富，其蛋白質含量約為38%，是谷類的4～5倍，除糖類較低外，其他營養成分，如脂肪、鈣、磷、鐵和維生素B1、B2等人體必需的營養物質都明顯高于谷類和薯類食物[1]。大豆蛋白含有8種人體必需氨基酸，且比例比較合理，只是賴氨酸含量相對稍高，而蛋氨酸和半胱氨酸含量較低[2]。大豆蛋白是一種重要的蛋白資源，特別是大豆分離蛋白，含蛋白質90%以上，是一種優良的食品原料[3]。用于大豆分離蛋白改性的方法很多，通過物理法、化學法或生物酶法可對大豆蛋白進行改性，經改性后的大豆蛋白功能特性得到改善，常用的是化學法，主要有酸作用、磷酸化、酯化、酰化和糖基化等。其中，糖基化修飾由于其具有自發進行，無需添加化學試劑，加熱即可加速反應等優點而成為一種較為理想的改性方法[4]。試驗的大豆蛋白糖基化改性是利用大豆蛋白自身糖分，使其氨基酸與多羥基化合物葡萄糖在堿性環境中發生美拉德反應（羰氨反應），生成葡萄糖-大豆分離蛋白復合物，促使蛋白結構和功能發生變化，提升大豆蛋白功能特性與營養價值[5-7]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗原料

脫脂豆粕：山東山松生物制品有限公司（蛋白質≥51%）。

1.1.2 主要試劑

石油醚、無水乙醇、甲醇、氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸、濃硫酸（均為分析純，天津市凱通化學試劑有限公司）；考馬斯亮藍G250、SDS、β-巰基乙醇、溴酚藍、甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺、過硫酸銨、氫氧化鉀、甘油、低分子量蛋白質Marker（北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.3 試驗儀器與設備

DYY-7C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；723可見分光光度計（上海菁華科技有限儀器公司）；HH系列數顯恒溫水浴鍋（金壇市科析儀器有限公司）；RE-52AA旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-III循環水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；TS-2000多用脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；HC-2064高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 大豆分離蛋白的提取

采用堿提酸沉法將脫脂大豆內的蛋白質溶解在稀堿溶液中，50 ℃恒溫攪拌2 h，離心除去豆粕中的不溶物，用酸將大豆蛋白提取液的pH調至等電點，使大豆蛋白沉淀析出，再經分離水洗，回調pH至中性，冷凍干燥備用[2,8-9]。

1.2.2 糖基化改性大豆蛋白

采用堿提酸沉法將脫脂大豆內的蛋白質溶解在稀堿溶液中，50 ℃恒溫攪拌2 h，離心除去豆粕中的不溶物，用酸將大豆蛋白提取液的pH調至等電點，使大豆蛋白沉淀析出，經分離水洗，按一定比例加入5%的葡萄糖，置于95 ℃水浴攪拌，反應一段時間后水浴冷卻，調節pH至等電點，回調pH至中性，冷凍干燥備用[5]。

1.2.3 不同溫度下的溶解度

配制1%蛋白溶液攪拌均勻后，于不同溫度梯度（50，60，70，80，90和100 ℃）恒溫水浴下加熱1 h，調節至pH 7，取1 mL樣液，離心后取上清液，采用考馬斯亮藍法測定上清液中蛋白濃度。

1.2.4 不同pH下的溶解度

配制1%蛋白溶液攪拌均勻后，調節pH（2，3，4，4.5，5，6，7，8，9，10，11和12），于不同梯度下取1 mL樣液，離心后取上清液，采用考馬斯亮藍法測定上清液中蛋白濃度。

1.2.5 不同離子強度下的溶解度

配制1%的蛋白溶液攪拌均勻后，稱取氯化鈉以配備不同濃度（0.01，0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，0.90和1.00 mol/L）的鹽離子溶液，各取1 mL樣液，離心后取上清液，采用考馬斯亮藍法測定上清液中蛋白濃度。

1.2.6 SDS-PAGE電泳

依照Laemmli[10]的方法。濃縮膠質量分數5%，分離膠質量分數12%，樣品上樣量5 μL。恒壓電泳，電流16 mA，濃縮膠電壓100 V，分離膠電壓150 V。電泳結束后，電泳膠片先固定3 h后，染色，脫色結束后，用成像儀進行成像。

2 結果與分析

2.1 糖基化改性前后大豆蛋白的溶解度

2.1.1 溫度對改性前后大豆蛋白溶解度的影響

由圖1可知，溫度70～90 ℃之間，未改性的大豆蛋白溶解度下降明顯，這是由于熱動能的增加破壞蛋白質分子內氫鍵，導致蛋白質結構的展開（變性），蛋白質內部的疏水基團暴露，促使蛋白質聚集沉淀。

90～100 ℃溶解性增加，可能是因為溫度過高導致蛋白亞基和展開的肽鏈結構發生折疊，使上清液中的蛋白濃度略有增大[11-12]。

圖1 溫度對改性前后大豆蛋白溶解度的影響

糖基化改性大豆蛋白在50～90 ℃溶解性增加，80～90 ℃尤為明顯。這是由于糖基化反應在大豆蛋白表面接枝糖分子并引入親水性羥基，大豆蛋白與水分子之間的作用增強，且接枝的糖分子使蛋白質的空間結構增大并趨于穩定，阻礙蛋白質分子聚集，從而增大蛋白質的溶解度[12-14]。90～100 ℃溶解度降低，是由于糖基化使大豆蛋白部分分子結構得以展開，蛋白質分子內部的疏水基團暴露，使其數量增加，分子間的疏水作用增強，導致蛋白質分子相互聚集沉淀從而使溶解性降低[13]。

2.1.2 pH對改性前后大豆蛋白溶解度的影響

由圖2可知，大豆分離蛋白的溶解度和溶液pH的變化有密切關系，成明顯的U字型結構。pH在4.3等電點附近時大豆蛋白的溶解性最低，pH 2～4.3蛋白溶解度隨pH升高而降低，pH 4.3～12之間蛋白溶解度隨pH升高而升高，pH 12時達到最大。因為大豆蛋白分子含有氨基和羥基，是兩性分子。在酸性介質中，蛋白質分子主要以正離子狀態存在，電荷相互排斥，分子分散性好，溶解度較高；隨著pH升高，蛋白質所帶電荷被中和，由電荷引起的各殘基之間的靜電排斥力消失，蛋白質分子便緊密地排列在一起，降低與水分子的結合能力，此時蛋白質最不穩定；隨著pH繼續升高，大豆蛋白變為負離子，電荷相互排斥，溶解度升高[15]。

圖2 pH對改性前后大豆蛋白溶解度的影響

改性后的大豆蛋白在等電點附近的溶解度略微高于未改性的大豆蛋白，但在其余兩側溶解性比未改性的大豆蛋白低。這是因為糖分子的還原末端與大豆蛋白的自由氨基發生反應，減少了大豆蛋白所帶的正電荷，相對增加其所帶的負電荷，使其在等電點處溶解性增強。

糖基化修飾使大豆蛋白在等電點區域具有了更好的親水性，在等電點附近有較高的溶解度，這在食品加工中有很重要的應用。在偏離等電點的范圍，糖基化改性大豆蛋白的溶解性表現出降低趨勢。

2.1.3 離子強度對改性前后大豆蛋白溶解度的影響

由圖3可知，離子強度0.01～0.05 mol/L時，未改性大豆蛋白溶解度降低，因為蛋白質溶液凈電荷量增加，因此帶上較厚的水化膠層導致大豆蛋白的溶解性下降；離子強度0.05～0.5 mol/L時，溶解度升高，是由于鹽離子結合親水基，增加蛋白質分子表面的電荷，從而增強蛋白質分子與水分子的作用，使蛋白質溶解度增大，這種現象稱為鹽溶；離子強度0.5～1.0 mol/L時，溶解度降低，是由于高濃度中性鹽，破壞蛋白質的水化層和電荷，從而使蛋白質沉淀，這種現象稱為鹽析[16]。

改性后大豆蛋白在離子強度大于0.3 mol/L范圍內溶解度不斷升高，這是由于蛋白與糖分子的結合比較緊密，蛋白質基本不受高鹽的影響。

圖3 離子強度對改性前后大豆蛋白溶解性的影響

2.2 糖基化改性大豆蛋白組分SDS-PAGE分析

2.2.1 溫度變化

由圖4可知，非還原電泳圖譜中濃縮膠頂端顏色較深條帶在還原電泳中消失，而非還原電泳圖譜中條帶顏色很淺的B亞基和A3亞基在還原電泳中顏色變深，說明不同溫度下糖基化大豆蛋白的B亞基和A3亞基通過分子間或分子內二硫鍵形成分子質量較大的可溶性聚集體。隨著溫度升高，濃縮膠頂端條帶顏色加深，說明溫度升高加劇B亞基的聚集。隨著溫度升高，糖基化大豆蛋白的非還原電泳圖譜變化不大，而還原電泳圖譜中分離膠頂端的條帶顏色在100 ℃明顯變淺，結合圖1數據，說明這部分大分子亞基在溫度從90 ℃到100 ℃的過程中變為不溶性聚集體，導致糖基化大豆蛋白溶解度出現大幅下降的結果[17]。

圖4 糖基化改性大豆蛋白非還原（N）和還原（R）電泳圖譜

2.2.2 pH變化

由圖5可知，非還原電泳圖譜中，等電點附近幾乎沒有條帶，而在還原電泳圖譜中雖能辨識α、A和B亞基，但顏色非常淺，與圖2結果相符。非還原和還原電泳圖譜中，pH 2的亞基條帶中β亞基缺失，說明在酸性條件下β亞基的溶解性差。此外，非還原電泳圖譜中隨著等電點右側pH升高，B亞基條帶的顏色逐漸加深，說明堿性增強有助于B亞基聚集體二硫鍵的斷裂。還原電泳圖譜中，等電點右側不同pH的亞基分布相似，說明隨著pH升高，所有亞基的溶解度均有升高。

圖5 糖基化改性大豆蛋白非還原（N）和還原（R）電泳圖譜

2.2.3 離子強度變化

圖6可知，對比溫度條件和pH條件，非還原電泳圖譜中濃縮膠頂端條帶消失，說明離子強度增加導致這部分亞基發生聚集變為不可溶性聚集體。隨離子強度增加，還原電泳圖譜中分離膠頂端的亞基條帶和B亞基逐漸消失又逐漸恢復，對照圖3的結果分析可知，隨著離子強度增加，分離膠頂端的亞基條帶和B亞基的溶解度呈現先下降后上升趨勢，這是造成糖基化大豆蛋白溶解度變化的主要原因。

圖6 糖基化改性大豆蛋白非還原（N）和還原（R）電泳圖譜

3 結論

糖基化改性大豆蛋白隨著溫度的升高呈現先增大后減小的趨勢，在90 ℃達到最高；隨著pH增大呈現先減小后增大趨勢，pH在4.3等電點附近時大豆蛋白的溶解性最低；隨著鹽離子濃度增加，其溶解性先增大后減小再增大。SDS-PAGE結果表明，不同溫度下糖基化大豆蛋白的B亞基和A3亞基通過分子間或分子內二硫鍵形成分子質量較大的可溶性聚集體，加入β-ME后，部分大分子亞基形成不溶性聚集體；酸性條件下糖基化大豆蛋白表現出β亞基的缺失，而堿性條件下則有利于B亞基聚集體二硫鍵的斷裂從而提高溶解度；隨著離子強度增加，糖基化大豆蛋白B亞基的溶解度呈現先下降后上升趨勢。