原花青素對鐵超載大鼠腦內二價礦物質元素、氧化應激及CREB、GLUT-1基因表達的影響

云少君 何興帥 褚東陽 張文芳 馮翠萍 (山西農業大學食品科學與工程學院，山西 太谷 030801)

鐵(Fe)對于大腦功能的發揮至關重要〔1,2〕。然而，Fe超載(IO)所誘導的氧化應激卻極易影響腦組織，腦IO是許多神經退行性病變的共同病理變化〔3〕。老年人群由于生理特征極易發生腦內Fe的蓄積〔4〕。

Fe失衡會影響其他金屬的代謝。此外，胰島素信號及機體糖代謝亦受到Fe的影響〔5〕。研究表明，去Fe治療可以增加胰島素受體的表達，增進其與胰島素的結合，同時上調某些參與葡萄糖攝取的基因，而葡萄糖轉運蛋白(GLUT)-1是血腦屏障上存在的最有效的轉運系統之一〔6,7〕。環磷酸腺苷(cAMP)反應元件結合蛋白(CREB)參與維持糖穩態和胰島β細胞功能，具有改善神經系統等方面的作用〔8,9〕，其同時受到神經細胞氧化應激的影響〔10〕。因此，大腦Fe穩態的維持是至關重要的。目前對抗ID所用的去Fe胺等螯合劑均會出現不同程度的副反應，因此，許多天然產物越來越受到人們的重視。在黑茶和紅酒中普遍存在的原花青素(PAs)具有廣泛的生物、藥理和化學保護特性，可抑制自由基生成，提高抗氧化酶活性，有效地螯合金屬〔11，12〕。前期的研究也表明，葡萄籽原花青素(GSPAs)能抑制大豆種子鐵蛋白中Fe的吸收〔13〕。本研究擬通過構建IO大鼠，并通過給予GSPAs的干預，探討其對腦內Fe及其他二價礦物元素的影響，分析其對腦內氧化應激狀態的影響，最后從糖代謝相關的GLUT-1、CREB基因的表達變化分析GSPAs對IO所引起腦損傷的改善作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 GSPAs(天津尖峰有限責任公司)；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；RNAiso Plus、SYBR? Premix Ex Taq TMⅡ試劑盒、PrimeScriptTM RT Master Mix試劑盒、Loading Buffer(大連TaKaRa公司)；DNA Marker(武漢華美生物工程公司)；PCR引物〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕；焦碳酸二乙酯(DEPC，上?；瞪锛夹g有限公司)。其他試劑均為國產分析純。

1.2儀器 主要有 電感耦合等離子體質譜儀〔iCAP-Q，賽默飛世爾科技(中國)有限公司〕、核酸蛋白分析儀(BioPhotometer plus，德國Eppendorf公司)、瓊脂糖凝膠電泳儀(DYCP-31CN型，北京六一生物科技有限公司)、實時熒光定量PCR儀(Mx3000P，美國Stratagene公司)。

1.3動物處理 8周齡SPF級雄性SD大鼠(由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供)，隨機分為：NC 組、IO組、GSPAs 組、Test 組各10只。參照文獻〔14〕，IO組和Test組隔天腹腔注射100 mg/(kg·bw)右旋糖酐Fe，GSPAs組和Test組每天灌胃100 mg/(kg·bw)的GSPAs，以生理鹽水消除應激性誤差。10 d試驗期結束后，取大鼠腦組織保存于-80℃。

1.4腦組織Fe、Ca、Zn、Mg、Cu的測定 參照文獻〔15〕，通過電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)進行檢測。

1.5腦組織GSH-Px、CAT的測定 參照相應試劑盒說明書進行檢測。

1.6qRT-PCR檢測 CREB及GLUT1基因表達的測定 參照文獻〔15〕，進行qRT-PCR實驗。PCR擴增條件為：95℃ 5 min；95℃ 10 s、60℃ 30 s(45 cycles)；95℃ 15 s、60℃ 1 min、95℃ 15 s。引物序列(5′>3′)為：β-actin上游：TACCCAGGCATTGCTGACAG；下游：AGCCACCAATCCACACAGAG。CREB上游：CCCCAGCACTTCCTACACAG；下游：CCCCAGCACTTCCTACACAG。GLUT-1上游：GCTGTGGCTGGCTTCTCTAA；下游：CCGGAAGCGATCTC-ATCGAA。

1.7統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析，并以Turkey法進行均數間的兩兩比較。

2 結 果

2.1腦組織Fe、Ca、Zn、Mg、Cu的含量 與NC組比較，IO組Fe、Ca含量顯著升高，Zn含量顯著降低(均P<0.05)；GSPAs組Zn、Mg含量顯著升高(均P<0.05)；Test組Ca含量顯著升高(P<0.05)；與IO組比較，GSPAs組Fe、Ca顯著降低，Zn、Mg顯著升高(P<0.05)，Test組Fe含量顯著降低(P<0.05)；各組Cu含量均無明顯差異(P>0.05)。見表1。

2.2腦組織抗氧化活性的影響 與NC組比較，IO組腦中GSH-Px、CAT活性明顯降低(均P<0.05)；GSPAs組GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)。與IO組比較，GSPAs組、Test組GSH-Px、CAT活性均明顯升高(均P<0.05)。見表2。

表2 各組腦組織中GSH-Px、CAT的活性

2.3腦海馬組織CREB、GLUT-1 mRNA表達量的影響 與NC組比較，IO組海馬CREB、GLUT-1 mRNA表達量明顯下降(均P<0.05)；GSPAs組中CREB、GLUT-1 mRNA表達量明顯升高(均P<0.05)。與IO組比較，GSPAs組Test組中CREB、GLUT-1 mRNA表達量均明顯升高(均P<0.05)。見表3。

表3 各組腦海馬中CREB、GLUT-1 mRNA表達量

3 討 論

金屬元素對于細胞內穩態的維持至關重要，過量補充Fe會導致機體IO。L型Ca通道可以在Fe過量情況下吸收Fe2+〔16〕。本研究推測腦組織過多的Fe誘導了Ca通道的開放和Ca的內流，導致Ca累積在細胞內引起組織中的Ca含量增高。IO導致Zn的下降，二價金屬轉運體(DMT)-1可以攝取非轉Fe蛋白結合Fe，同時具有廣泛的底物結合特異性，有利于Fe2+,Zn2+,Mn2+,Co2+,Cd2+,Cu2+,Ni2+和Pb2+的結合〔17〕。本研究中過量的Fe可能首先占據DMT-1，因此導致體內Zn2+吸收減少，從而導致腦組織Zn含量降低。GSPAs可以通過3∶1的比例與Fe結合〔12〕，而先前的研究也表明GSPAs可以抑制大豆種子Fe蛋白在大鼠體內的Fe吸收〔13〕，因此本研究推測GSPAs會影響Fe的吸收而減少其在腦組織中的沉積，從而對抗Ca、Zn、Mg的代謝失衡。本研究與上述結果相一致，即GSPAs通過螯合作用影響了Fe和Ca的攝取，進而影響了Zn、Mg的含量。

Fe負荷會導致組織氧化損傷，而GSPAs具有非常強的抗氧化活性〔18〕。本研究結果說明GSPAs通過影響抗氧化酶對抗IO所誘導的氧化應激。

研究表明，Fe代謝與葡萄糖代謝具有雙向的調節關系，過多的Fe沉積會干擾葡萄糖代謝而引起高胰島素血癥；而另一方面高胰島素血癥則會通過增加細胞外Fe的攝入，轉Fe蛋白受體的重分布及下調Fe調素引起Fe的沉積〔19～21〕。GLUT-1能夠介導葡萄糖順濃度梯度進入胞質內〔7〕。CREB與機體糖代謝亦密切相關〔22〕。本試驗中過量的Fe可能通過氧化應激進而干擾胰島素信號，最終影響GLUT-1及CREB的表達，而GSPAs能夠螯合過量的Fe，并改善氧化應激狀態，從而通過上調GLUT-1及CREB的表達改善細胞的糖代謝，其調控機制有待后續深入研究。