RTN1-C基于Nogo-A/RhoA/ROCK2信號通路對腦卒中模型大鼠認知功能的干預作用

郭丹 高兵 欒梅

(1錦州醫科大學附屬第三醫院神經外科，遼寧 錦州 121000;2遼寧錦州古塔區醫院院辦;3錦州醫科大學附屬第三醫院老年科)

腦卒中是由腦血管破裂、局部腦組織區域血液供應障礙導致患者腦組織因缺血、缺氧而發生壞死的一種疾病，具有較高的發病率和死亡率，嚴重威脅人類生命健康，且腦卒中后會遺留一些嚴重的并發癥〔1,2〕，如言語障礙、認知障礙、記憶力減退，嚴重影響患者的生存質量。內質網膜相關蛋白(RTN1)稱為神經內分泌蛋白，在腦組織中的表達量最多，可減輕腦梗死腦組織的損傷程度，其作用機制與機體內的應激反應和各種通路蛋白相關聯〔3〕。髓鞘相關生長抑制因子(Nogo-A)可參與神經細胞遷移和擴散，在阻止軸突再生和腦卒中后軸突重建方面具有非常重要的作用〔4,5〕。有效抑制Rho激酶(Rho)A的水平可促進大鼠神經干細胞神經突的生長與神經元的分化。在小膠質細胞中，活化的Rho相關卷曲蛋白激酶(ROCK)會影響神經炎癥和多巴胺能神經變性，因此，抑制ROCK可調節軸突生長水平，保護神經元不受傷害〔6〕。本文分析RTN1-C基于Nogo-A/RhoA/ROCK2信號通路對腦卒中模型大鼠認知功能的干預作用。

1 資料與方法

1.1研究動物 選取清潔級健康雄性大鼠48只，鼠齡2～3個月，平均鼠齡(2.63±0.22)個月，體重250～330 g，平均體重(305.26±8.24)g，大鼠由廣東省實驗動物監測所提供，許可批號：SCXK 2018-0044。飼養環境：溫度27℃，濕度60%，通風10次/h，自由飲食飲水。

1.2腦卒中大鼠模型的建立 從48只雄性大鼠中隨機選取12只為正常組，剩余36只參考文獻〔7〕建立腦卒中模型，大鼠腹腔注射5% 0.1 g/kg氯胺酮進行麻醉處理，將大鼠仰臥位放置在手術臺上，頸部備皮、消毒，在頸部正中切開暴露出左頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈，然后分離出頸外動脈、夾閉頸總動脈，盡量不刺激迷走神經，自頸外動脈逆行穿刺插管后注入1 ml/kg栓子鹽水混懸液，立刻結扎頸外動脈，開放頸總動脈夾，血液會將栓子沖入頸內動脈，即腦卒中模型建立成功。

1.3干預分組 將36只模型大鼠隨機分為模型組、對照組、RTN1-C干預組，各12只，模型組、對照組給予等體積的生理鹽水干預，對照組將5 μl的慢病毒以0.5 μl/min的速率注射到大鼠右側側腦室中，針頭固定5 min，為無意義序列，RTN1-C干預組與對照組方法一樣，注射5 μl的慢病毒,其引物序列為5′-CACCGGAGCTTGATCACCCTTTCTTCAAGA GAGAAAGGGTGATATCAAGCTCCTTTTTTG-3′,由上海吉瑪制藥技術有限公司提供，以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參蛋白，其上下游引物為5′-CCCATGGCAAGTTCAAAGGCA-3′,5′-TGGTGAAG-ACGCCAGTAGATT-3′。所有大鼠連續干預3 w。

1.4Morris水迷宮實驗、四肢抓握能力、協調能力檢測 建模后12 d采用Morris水迷宮檢測大鼠的認知功能，Morris水迷宮是一個直徑為160 cm、深50 cm的圓形水池，將東、西、南、北4個方向的水池劃分為T1、T2、T3、T4 4個象限，在每個象限的池壁中間分別設置一個特殊的標記，以供大鼠記憶，向水池內注水、加入無毒的黑色色素，使平臺隱匿，讓各組大鼠在水池內游泳，用攝像機跟蹤大鼠游泳過程，使用專門的計算機軟件完成數據采集和圖像分析，然后進行定位航行實驗，過程為將大鼠放置在水池中，讓其在水池內游泳，將大鼠找到隱匿平臺的時間稱為潛伏期，每只大鼠限時60 s尋找平臺，若不能找到平臺，則潛伏期為60 s。潛伏期越短，表明大鼠的認知功能越強。建模2 d后采用網屏測試實驗檢測大鼠四肢抓握能力，自制40 cm×30 cm的不銹鋼網袋，網眼為2 cm×2 cm，將網屏放置在離地面20 cm的位置，將大鼠放置在上面，然后將網屏旋轉為垂直狀態并保持5 s，觀察大鼠是否能夠從網屏上跌落下來，評估標準、總分為3分，0分為大鼠的前爪能夠握住網屏，且堅持5 s，不會跌落，1分為大鼠能夠暫時抓住網屏，下滑一段距離但不會跌落，2分為大鼠在5 s內跌落，3分為網屏轉動時大鼠便跌落。建模7 d后采用疲勞轉棒實驗測試大鼠的協調能力，使用ZB-200疲勞轉棒儀(成都泰盟軟件有限公司)檢測大鼠的協調能力，大鼠的初始轉速為10 r/min，5 min后將速度提升至40 r/min，保持5 min，使用計算機軟件記錄大鼠在轉棒上行走的時間，大鼠在轉棒上行走的時間越長，表明大鼠的協調能力越強。

1.5超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)水平檢測 在大鼠隱靜脈處進行采血，待大鼠固定后，將后腿外側區域剃毛后暴露采血點，將采血針刺入采血點，采集1 ml血液，用酶聯免疫吸附試驗檢測SOD、MDA、ROS水平，先用包被緩沖液將SOD、MDA、ROS稀釋至最合適的濃度，在37℃下儲存4 h，用洗滌液洗滌3次，每次4 min，加入含有抗原的標本，在特異抗體和抗原結合下形成抗體復合物，再次洗滌后，固相載體上只剩下特定抗體，加入酶標記特異性抗體與復合物中的抗體結合，使抗體被酶標記，洗滌后，載體上的酶量表示特定抗體的量，添加底物來顯現顏色，通過顏色深度來分析SOD、MDA、ROS的水平。

1.6病理學觀察 腹腔注射10% 0.35 ml/100 kg，將大鼠放置在冰塊上，迅速斷頭處死取腦，為方便切片，將大鼠的腦組織放置在冰盒上，在-25℃下速凍20 min，然后用刀片去除大鼠腦組織的嗅球和小腦部分，從腦前極開始進行冠狀切片，片厚2 mm，將切好的腦片浸入預熱的三苯基四氮唑溶液中進行染色，每孔一片，在37℃的烘箱中避光孵育25 min，10 min后將腦片翻面，保證兩面均染色，正常腦組織為紅色，腦梗死組織為白色。

1.7血腦屏障通透性、腦梗死率、腦血流灌流量、大腦皮層完整神經元數目檢測 斷頭處死后，稱取200 mg的腦梗死組織離心，取上清液，在酶標儀630 nm處測定吸光度，按照標準曲線計算大鼠的血腦屏障通透性。采用Image圖像處理軟件，計算腦梗死率=梗死區總面積/全腦總面積×100%。將取出的腦組織放置在4%多聚甲醛中，在4℃下遮光保存48 h，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，激光波長為488 nm，20×，z軸方向每0.5 μm掃一層，共掃100個層面，將所獲得的圖像進行三維重建，綠色熒光所占體積為血漿容量，腦血流灌注量=掃描區血漿容量/掃描區總容量×100%。在每張腦組織切面梗死的區域選取2個固定視野進行拍照，用Imagepro Plus軟件分析圖像，計算每組200倍視野內大腦皮層完整神經元數目。

1.8Nogo-A、RhoA、ROCK2蛋白檢測 Western印跡法檢測Nogo-A、RhoA、ROCK2、環腺苷酸應答元件結合蛋白(CREB)，將取出的腦組織超聲粉碎，加入1 ml的RIPA裂解液和10 μl的苯甲基磺酰氟(PMSF)，取上清液加入蛋白上樣緩沖液，在100℃下變性15 min，然后將樣品進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，每個孔中加入40 μg的總蛋白，電泳結束后將蛋白轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，轉膜時間為60 min，5%脫脂奶粉封閉60 min，然后加入Nogo-A、RhoA、ROCK2的一抗抗體，在4℃下過夜，第2天取出后在37℃下放置60 min，TBST洗膜3次，每次15 min，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，在37℃下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次15 min，然后加入電化學發光(ECL)暗室曝光，利用Image J軟件掃描條帶灰度值，計算Nogo-A、RhoA、ROCK2的量。

1.9統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1RTN1-C對腦卒中模型大鼠潛伏期、四肢抓握能力評分、行走時間的影響 與正常組相比，模型組、對照組、RTN1-C干預組潛伏期顯著延長，四肢抓握能力評分顯著升高，行走時間顯著縮短(均P<0.05)；與模型組相比，對照組、RTN1-C干預組潛伏期顯著縮短，四肢抓握能力評分顯著降低，行走時間顯著延長(均P<0.05)；與對照組相比，RTN1-C干預組潛伏期顯著縮短，四肢抓握能力評分顯著降低，行走時間顯著延長(均P<0.05)。見表1。

組別潛伏期(s)四肢抓握能力評分(分)行走時間(min)血腦屏障通透性(μg/g)腦梗死率(%)腦血流灌流量(%)大腦皮層完整神經元數目(個)正常組9.73±1.640.50±0.03171.42±2.5925.94±2.520.00±0.0029.53±2.8670.54±3.19模型組39.54±2.431)2.99±0.011)42.15±2.611)281.83±6.101)26.42±1.591)8.53±0.761)10.68±1.621)對照組33.99±1.511)2)2.43±0.021)2)94.00±2.791)2)157.69±5.041)2)22.56±0.081)2)19.00±1.411)2)16.98±2.231)2)RTN1-C干預組26.49±3.101)2)3)2.14±0.281)2)3)102.04±5.661)2)3)102.89±2.831)2)3)18.40±2.161)2)3)20.19±2.471)2)3)46.46±2.271)2)3)F/P值393.414/0.001687.715/0.0012 540.314/0.0017 200.710/0.001914.391/0.001209.600/0.0011 608.205/0.001

2.2RTN1-C對腦卒中模型血腦屏障通透性、腦梗死率、腦血流灌流量、大腦皮層完整神經元數目的影響 與正常組相比，模型組、對照組、RTN1-C干預組血腦屏障通透性、腦梗死率顯著升高，腦血流灌流量、大腦皮層完整神經元數目顯著降低(均P<0.05)；與模型組相比，對照組、RTN1-C干預組血腦屏障通透性、腦梗死率顯著降低，腦血流灌流量、大腦皮層完整神經元數目顯著升高(均P<0.05)；與對照組相比，RTN1-C干預組血腦屏障通透性、腦梗死率顯著降低，腦血流灌流量、大腦皮層完整神經元數目顯著升高(均P<0.05)。見表1。

2.3各組病理學觀察 正常組腦組織無明顯病理改變，神經細胞排列緊密且整齊；模型組腦組織周圍出現明顯的水腫和壞死，細胞排列不規則、疏松、細胞間隙大、呈網狀結構、神經細胞變形壞死、有大量的炎性細胞浸潤；對照組腦組織腫脹減輕，無網狀結構、固縮細胞減少；RTN1-C干預組腦組織腫脹減輕、神經元水腫變性減少，炎癥細胞浸潤減輕，細胞周圍的間隙減少。見圖1。

圖1 各組腦組織病理學觀察(三苯基四氮唑染色，×200)

2.4RTN1-C對腦卒中模型大鼠SOD、MDA、ROS水平的影響 與正常組相比，模型組、對照組、RTN1-C干預組SOD水平顯著降低，MDA、ROS水平顯著升高(均P<0.05)；與模型組相比，對照組、RTN1-C干預組SOD水平顯著升高，MDA、ROS水平顯著降低(均P<0.05)；與對照組相比，RTN1-C干預組SOD水平顯著升高，MDA、ROS水平顯著降低(均P<0.05)。見表2。

2.5RTN1-C對腦卒中模型大鼠Nogo-A、RhoA、ROCK2通路蛋白的影響 與正常組相比，模型組、對照組、RTN1-C干預組Nogo-A、RhoA、ROCK2水平顯著升高(均P<0.05)；與模型組相比，對照組與RTN1-C干預組Nogo-A、RhoA、ROCK2水平顯著降低(均P<0.05)；與對照組相比，RTN1-C干預組Nogo-A、RhoA、ROCK2水平顯著降低(均P<0.05)。見表2和圖2。

圖2 Western印跡法分析各組Nogo-A、RhoA、ROCK2蛋白表達

3 討 論

腦卒中是由局部腦組織缺血、腦組織水腫、乳酸累積、代謝紊亂等原因引起的，可導致嚴重認知功能障礙綜合征，對患者的生活質量造成了極大的影響〔8，9〕。

RTN1家族共有RTN1-A、RTN1-B、RTN1-C 3個剪接體，RTN1-C主要在神經元和神經內分泌組織中表達，RTN1-C在腦卒中患者中表達下調可減輕腦組織損傷程度〔10，11〕。研究表明〔12〕，抑制RTN1-C表達可減輕腦卒中患者腦組織的損傷程度，并可恢復缺血再灌注中部分受損的神經功能，因此，RTN1-C可能為治療腦卒中的一個靶點。本研究表明，RTN1-C可增強腦卒中模型大鼠的認知功能、四肢抓握能力和協調能力。

血腦屏障是腦毛細血管壁與神經膠質細胞形成的血漿與腦細胞之間的屏障及血漿和腦脊液之間的屏障，這些屏障可阻止機體中有害的物質通過血液進入到腦組織〔13〕，對維持中樞神經系統的正常生理狀態具有重要的意義〔14，15〕。腦梗死率是梗死區總面積與全腦總面積的比例，腦血流量是單位時間內血液通過腦血管某橫截面積的流量。本研究提示RTN1-C可有效降低大鼠的血腦屏障通透性、腦梗死率，提高腦血流灌流量，增加大腦皮層完整神經元的數目。

SOD具有催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫、維持機體內氧化和抗氧化平衡的作用，是參與體內氧化應激反應的重要因子，SOD水平越低表明機體內的氧化應激反應越強烈〔16，17〕。MDA是機體內脂質氧化終極產物，其含量越高表明機體內脂質氧化反應越強烈，對機體損害越嚴重。ROS是機體內吞噬細胞發揮其吞噬作用和殺傷作用的重要介質，當ROS水平失去平衡時，就會對機體造成損傷〔18〕。本研究顯示，RTN1-C干預可有效緩解腦卒中大鼠腦損傷，表明其作用機制可能是通過改善腦梗死大鼠體內SOD、MDA、ROS水平，抑制腦卒中大鼠體內氧化應激反應的發生有關。

Nogo-A在抑制神經細胞的遷移和擴散、阻止軸突再生和腦卒中后軸突重建方面具有重要作用〔19〕。RhoA是Rho蛋白家族的成員之一，活化的RhoA可導致成纖維細胞肌動蛋白應力纖維的形成，進而導致軸突的回縮和生長錐的塌陷。有研究表明〔20〕，可通過抑制RhoA蛋白的過度活化，改善腦卒中大鼠的認知功能和記憶能力，促進神經突軸的重塑。ROCK2可通過磷酸化肌球蛋白輕鏈，使突觸前和突觸后的細胞骨架蛋白解聚，進而抑制中樞神經系統損傷后軸突生長，促進突觸的重塑，高水平的Nogo-A、RhoA、ROCK2在腦卒中大鼠中可限制軸突的生長和神經的可塑性〔21〕。本研究結果顯示，RTN1-C干預可通過調控Nogo-A、RhoA、ROCK2通路蛋白水平來改善大鼠的認知功能和記憶能力。

綜上，RTN1-C干預通過調控Nogo-A、RhoA、ROCK2通路蛋白、SOD、MDA、ROS水平，可改善腦卒中大鼠的認知功能、抑制氧化反應的發生，進而提高大鼠四肢抓握能力和協調能力，降低大鼠的血腦屏障通透性、腦梗死率，提高腦血流灌流量，增加大腦皮層完整神經元的數目。