褪黑素通過抑制程序性細胞壞死對心肌缺血再灌注的保護作用

楊吉平 費琳 柴學軍 祁存芳,3

(1西安醫學院基礎醫學研究所 陜西省缺血性心血管疾病重點實驗室，陜西 西安 710021；2西安交通大學第一附屬醫院精神心理科；3青海大學醫學院解剖教研室)

缺血再灌注損傷(IRI)常引起患者出現多種并發癥，甚至死亡，是心肌缺血臨床治療效果不佳的主要原因，應用外源性藥物預防和治療是防止心肌細胞進一步損傷的重要策略，但是由于藥品的篩選、來源和副作用等問題，至今仍然未獲得效果滿意的藥物和干預方法〔1〕。因此，探尋人體內源性具有抗心肌缺血損傷的物質成為目前心肌保護方面的研究熱點之一。褪黑素(MLT)是由松果體產生的一種吲哚類激素，近年研究發現，它不僅對中樞神經系統的生物節律有調控作用，而且對心血管系統在生理和病理條件下也具有調節作用〔2〕，還對腦、心、肝和腎等器官的缺血損傷有明顯的保護作用〔3～6〕，因此，MLT已經成為近年保護心肌損傷領域的一個很有潛力的藥物。但是MLT抗心肌 IRI的機制尚未完全闡明，成為限制其進一步研發和應用的瓶頸。為此，本研究從程序性細胞壞死分子機制的角度出發，觀察MLT對大鼠心肌IRI的保護作用。

1 材料和方法

1.1實驗動物及分組 Wistar雄性大鼠40 只，220～250 g，購自西安交通大學實驗動物中心，隨機分4組，每組10只。模型組給予建立心肌IRI模型，給藥組是在IRI模型的基礎上在缺血前30 min及缺血后30 min，分2次腹腔注射MLT溶液，MLT低、高劑量組分別按1 mg/kg 和5 mg/kg 給予。假手術組只開胸不結扎。

1.2試劑及儀器 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染料和肌酸激酶(CK)活性檢測試劑盒購自北京 Solarbio 生物公司，Western印跡電泳儀和轉膜儀購自 Bio-Rad 公司。兔抗RIPK3 抗體購自 Abcam 公司，磷酸化人混合系列蛋白激酶樣結構域(MLKL)抗體購自 Milipore 公司，GAPDH 抗體購自武漢三鷹生物公司。MLT購自 Sigma 公司，使用前將MLT 5 mg 加 0.1 ml 二甲基亞砜溶解后，再用生理鹽水定容至 1 ml，4℃ 保存備用。

1.3心肌IRI模型的建立 將大鼠用2%戊巴比妥鈉 40 mg/kg 腹腔注射麻醉，仰臥位固定，行氣管插管后接人工呼吸機，呼吸頻率調為 55 次/min，潮氣量約 25 ml/kg，四肢連接心電圖機。胸骨左側縱行切口，于第 3 肋間隙分離肋間肌，進入縱隔，剪開心包膜，暴露心臟，以左冠狀靜脈為定位點，于左心耳根部下方約 2 mm 處進針，從肺動脈圓錐旁出針，用 5 號絲線結扎左冠狀動脈前降支，以心電圖Ⅱ導聯出現 S-T 段明顯抬高或 T 波高聳，心尖變白作為結扎成功的標志，缺血 50 min 后松開線結再灌注 3 h，即為大鼠心肌IRI模型建立。

1.4心肌梗死面積測定和蘇木素-伊紅(HE)染色 取新鮮大鼠心臟于-80℃冷凍50 min后，以結扎冠狀動脈的部位為分界，從心尖處開始橫切，基本垂直于心臟縱軸方向，每個心臟共切6片，片厚約1 mm，然后置于37℃，避光，1%TTC染液中，染色20 min，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后再用4%多聚甲醛固定24 h，拍照，用Image J軟件測量每組的梗死面積。各組另取1只大鼠麻醉后，用0.1 mol/L PBS徹底沖出循環內的血液，用4%多聚甲醛進行灌流固定，取出心臟后用4%多聚甲醛4℃后固定12 h，然后石蠟包埋，切片，進行常規HE染色，對比觀察各組心肌細胞和心肌結構的改變情況。

1.5血清CK活性的測定 大鼠IRI手術結束后，經左心室取全血1 ml，分離出血清，按 CK 活性檢測試劑盒說明書步驟進行操作，最后用酶標儀在波長 340 nm 處測定每組血清的吸光度 A 值。在 37℃，pH7.0 條件下，1 ml 血清每分鐘催化產生1 nmol NADPH 為一個 CK 酶的活性單位。CK 活性值(U/ml)的計算按產品說明書給出的公式。

1.6Western印跡檢測 大鼠處死后，開胸暴露心臟，在冰上快速取出各組大鼠左心室前壁心肌組織少許，置于 1.5 ml EP 管中，每管加入 RIPA(pH 7.4)200 μl，超聲裂解 20 min，4℃，12 000 r/min，離心 15～20 min；將上清液轉移至另一個 EP 管中，BCA 法蛋白定量后上樣，每孔15 μl,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后濕轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉 1 h后 TBST 漂洗 3 次，然后分別加入 RIPK3(1∶200)、pMLKL(1∶500)和 GAPDH(1∶3 000)，4℃孵育過夜，TBST 漂洗 3 次，加辣根過氧化物酶(HRP)標記的相應二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，TBST 漂洗 4 次后 ECL發光，對各組蛋白表達的條帶灰度對比分析。

1.7統計學方法 采用SPSS19.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1MLT對心肌梗死面積的影響 將大鼠的心肌組織切片行 1% TTC染色后，心肌未梗死區域呈紅色，梗死區域呈現蒼白色，結果顯示，心肌梗死區與左冠狀動脈前支供血區域基本吻合，提示造模成功。模型組大鼠心肌梗死面積明顯高于假手術組(P<0.01)。MLT低劑量干預后，有降低梗死面積的趨勢，但統計學差異不明顯(P>0.05)；MLT高劑量則顯著減小缺血再灌注所致的梗死面積(P<0.01)。模型組血清 CK活性較假手術組明顯升高(P<0.01)。MLT干預后，血清CK活性較模型組明顯降低(P<0.05)，且隨著MLT濃度的升高，CK活性的下降更加顯著(P<0.01)，見表1。

表1 MLT對IRI的梗死面積和CK活性的影響

模型組心肌纖維明顯紊亂，呈波浪狀彎曲，或皺縮，甚至溶解，細胞間可見大量的炎性細胞浸潤、水腫，心肌肌質凝固、伊紅染色增強。MLT低劑量干預后，有改善病變的趨勢，但仍然可見凝固性收縮帶，橫紋不清或消失，心肌纖維粗大。MLT高劑量能明顯抑制心肌結構的上述病理變化，心肌壞死灶明顯好轉，仍可見炎細胞浸潤等。見圖1。

圖1 心肌缺血再灌注損傷后的心肌組織結構變化(HE染色，×400)

2.2MLT可抑制心肌IRI后程序性壞死關鍵蛋白的表達 Western印跡結果顯示，假手術組大鼠心肌組織中幾乎不表達 RIPK3 和 磷酸化MLKL蛋白，而當發生IRI后，如圖2所示，與假手術組相比，模型組大鼠心肌損傷區的 RIPK3 和磷酸化 MLKL 蛋白的表達均明顯上調(P<0.01)。與模型組比較，MLT低劑量組大鼠心肌損傷RIPK3 和磷酸化 MLKL蛋白表達降低(P<0.05)，而MLT高劑量組可使這兩種蛋白表達顯著下調(P<0.01)。見表2。

1～4：假手術組、模型組、MLT低劑量組、MLT高劑量組圖2 MLT對大鼠心肌IRI后 RIPK3 和 pMLKL 蛋白表達的影響

表2 MLT 對大鼠心肌 IRI 后 RIPK3 和 pMLKL 蛋白表達的影響

3 討 論

冠狀動脈病變所致的缺血性心臟病事件逐年升高，再灌注治療仍然是目前臨床上治療缺血性心血管疾病最有效的手段，主要通過藥物溶栓、經皮冠狀動脈介入治療和冠狀動脈搭橋術使冠狀動脈再通重新恢復血供。然而，再灌注是一把“雙刃劍”，一方面可以使缺血心肌恢復血液供應，另一方面會形成新的損傷，即IRI〔7〕。目前關于心肌IRI的研究主要集中在能量代謝障礙致氧自由基增多，細胞內鈣超載和繼發性炎癥反應等方面，但具體損傷機制仍不十分清楚〔8〕。研究發現，由 RIPK1/RIPK3/MLKL 介導的程序性壞死在心肌 IRI 中發揮著重要作用，應用 Necrostatin(Nec)-1能顯著減輕實驗動物的心、腦、腎和視網膜等器官的缺血性損傷〔9～11〕，因此，程序性壞死抑制劑有希望成為抗IRI的靶點藥物。RIPK3、MLKL的募集和磷酸化是程序性壞死信號通路中最重要的兩種蛋白質，本研究結果表明IRI可誘發心肌細胞發生程序性壞死。

MLT生理狀態下，體內含量極小，一般在pmol/L水平。MLT的生物學功能主要有清除氧自由基抗衰老，調節生物鐘促進睡眠，調節免疫、抗腫瘤等方面，常常作為保健性的膳食補充劑被廣泛應用。隨年齡的增長，松果體的鈣化不斷增加，60歲時松果體的鈣化率為64%～69%，故老年人的血漿MLT水平更低，然而老年人冠狀動脈供血不足常常患病率很高且嚴重〔12〕。有研究發現冠狀動脈旁路移植術后心肌 IRI 的程度與患者血漿中MLT的水平呈負相關，MLT的含量越高，心肌 IRI 的程度就越輕〔13〕。已知心肌缺血再灌注時程序性壞死顯著增強，MLT保護缺血再灌注誘發的心肌損傷作用是否與其抑制程序性壞死有關是本研究的切入點。本研究結果表明高劑量MLT能保護心肌細胞的IRI。MLT可通過抑制程序性細胞壞死從而發揮IRI的保護作用。綜上，MLT為人體的一種內源性物質，幾乎無不良反應，倘若能進一步應用于缺血再灌注性疾病的治療當中，將可能給更多的患者帶來好處。