應用TLC-CMS技術檢測核桃青皮中二芳基庚烷類化合物

楊衛民，杜京旗，王子奇

（呂梁學院呂梁林果植物化學省市共建山西省重點實驗室培育基地，山西省特色植物功能成分工程研究中心，山西呂梁 033001）

核桃（Juglans regia L.）又稱胡桃，屬于胡桃科核桃屬落葉喬木。核桃青皮為核桃果皮部分，又稱“青龍衣”，含有多種化合物，如醌類、二芳基庚烷類、多酚類、生物堿類、萜類等化合物，具有止痛止痢、祛風療癬、清熱解毒等功效。核桃青皮提取物中醌類、二芳基庚烷類、生物堿類等化合物還具有抗腫瘤的活性，成為了現階段核桃青皮研究的重點方向。

二芳基庚烷類化合物結構式見圖1。

核桃青皮中的二芳基庚烷類化合物是一種含有1,7-二芳基庚烷母核的天然化合物的總稱。二芳基庚烷類化合物可根據其結構劃分為線性二芳基庚烷、內環狀二芳基庚烷、大環二芳基庚烷3類，大環二芳基庚烷是比較常見的類型（圖1）。具有廣泛的藥理活性，是核桃青皮中主要的抗腫瘤活性成分，且化學結構獨特，具有非常高的研究價值，主要存在于許多植物的根部、莖部、表皮、花和果皮等部位。

圖1 二芳基庚烷類化合物結構式

近年來，國內外學者從核桃青皮中提取分離出其他大量化學物質，具有生物活性物質近50種。研究人員采用了BSLB法初步篩選了核桃青皮抗腫瘤活性成分，發現其乙酸乙酯提取物具有較明顯的抗腫瘤活性[1]。周媛媛等人[2]對核桃青皮中的二芳基庚烷類化合物進行了深度研究，并且進行了結構鑒定，探索出了5個二芳基庚烷類化合物。還有研究人員發現核桃青皮乙醇提取物中有4個強抗癌活性的環狀二芳基庚烷類化合物[3-7]。試驗以核桃青皮為原料，以75%甲醇為提取劑，經微波超聲波組合萃取儀輔助處理，用薄層層析分離純化獲得二芳基庚烷類化合物，應用Plate ExpressTM技術對其進行了檢測與表征。該技術可直接從TLC薄層板上獲取質譜圖，其優點是不經過樣品前處理，可快速從復雜混合物中獲得目標物分子質量信息，并對其進行檢測和鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗器材

材料：胡桃青皮（呂梁當地）。

試劑：甲醇、乙酸乙酯、苯、無水乙醇均為分析純；色譜甲醇；薄層硅膠板色譜分析板。

儀器：ALB-224型電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司產品；XH-300B型微波-超聲波組合合成/萃取儀，北京祥鵠科技發展有限公司產品；KH-3000Plus型薄層色譜儀，上海科哲生化科技有限公司產品；Expressions型質譜儀、Plate Express TLC-質譜接口，美國Advion公司產品；Tensor-11型傅里葉紅外光譜儀，德國布魯克公司產品。

1.2 試驗方法與步驟

1.2.1 核桃青皮中二芳基庚烷類化合物的提取

按料液比（1∶30，M/V）加入75%的甲醇，用微波超聲波萃取儀分為3個階段進行提取，每階段均為10 min，共30 min。在超聲波恒定的條件下，設置溫度分別為40，45，50℃；微波功率分別為100，200，300 MHz；超聲功率分別為850，900，800 W；模式15∶10，電機轉速為900 r/min。

甲醇提取液于轉速4 000r/min離心3次，每次10 min，合并上清液，收集濾渣。濾渣中加入乙酸乙酯，恒溫振蕩5 h，減壓過濾3次，獲乙酸乙酯相。在78℃下濃縮至膏狀，甲醇定容至25 mL。

1.2.2 薄層色譜分離純化

用微量進樣器吸取25μL的核桃青皮二芳基庚烷樣液，置于全自動點樣機上，設置點樣參數（點樣邊距10 mm，點樣間距10 mm，點樣寬度8 mm，點樣數目5，點樣量為3μL，點樣速度2 s/μL），在10×10硅膠板上進行點樣，共點樣15μL。

以苯∶乙酸乙酯（11∶1，V/V)為展開劑，將已點樣硅膠板放入展開劑液面高2~3 mm的層析缸內，待到展開劑前沿距離硅膠板頂端約1 cm處時，取出晾干。將硅膠板放入薄層色譜成像系統，于波長365 nm處的紫外光燈下觀察標記。

1.2.3 質譜檢測

用色譜甲醇和超純水作為流動相。使儀器和軟件處于工作狀態，將待測品薄層板置于TLC-質譜接口上，使激光對準圈出的色譜斑點中心處。用軟件操作進行取樣，點開譜圖界面對譜圖進行分析并保存。

1.2.4 紅外光譜檢測

將硅膠板上已標記的色譜斑點進行編號，摳取色譜斑點，甲醇溶解，過濾。

紅外光譜儀測量每一個樣品之前，都需要測量單通道背景光譜，然后將樣品用毛細管點樣至光學臺的金剛石上，再進行單通道樣品光譜的測量。每一個樣品測量后，都需要進行譜圖處理。例如，進行氣氛補償，可消除CO2、H2O的干擾，然后將檢測出來的光譜轉換成倒峰，選擇單峰檢索標出每一個特征峰，保存并進行分析。與文獻數據進行比對分析，記錄高度吻合的條帶。

1.2.5 旋光度和熔點檢測

設置自動旋光儀至模式2。在參數（長度1.0，濃度1.000，復測次數3次，波長1）下測定旋光度，計算平均值。模式1，在參數（長度1.0，比旋度設定為測量平均值，復測次數3次，波長1）下測定比旋度，取平均值。

待提取液完全結晶后用毛細管吸取樣液中，高度2~3 mm。然后開啟電源開關進行熔點測定。

2 結果與分析

2.1 核桃青皮中二芳基庚烷的提取率

核桃青皮中二芳基庚烷類化合物的提取率見表1。

表1 核桃青皮中二芳基庚烷類化合物的提取率

核桃青皮中二芳基庚烷的提取率：

平均提取率=[(197.0-196.9)/7.2+(197.1-196.9)/7.2+(197.1-196.9)/7.2]×100%÷3=1.6%.

2.2 薄層色譜分離純化與分析

核桃青皮乙酸乙酯相TLC成像圖見圖2。

圖2 核桃青皮乙酸乙酯相TLC成像圖

由圖2可知，核桃青皮乙酸乙酯相在苯∶乙酸乙酯（11∶1，V/V）下，于波長365 nm處紫外光觀察，展開效果良好，出現了5個色譜斑點，且圖像清晰，色譜斑點之間應保持適當的間距，分離效果良好。5個色譜斑點自上而下分別用字母A，B，C，D，E標記，便于進行紅外和質譜檢測與分析。

2.3 質譜檢測與分析

判定該二芳基庚烷類化合物的分子離子峰，根據文獻數據將討論范圍劃定到358 m/z左右。分子離子峰需要滿足幾個必要的條件，即該范圍譜圖內的最高質量（m/z較大者）的離子。

通過查閱文獻[2，8]，了解到了二芳基庚烷類化合物的相關質譜數據。EI-MS給出358[M]+，表明相對分子質量為358。

色譜斑點A質譜圖見圖3。

圖3 色譜斑點A質譜圖

由圖3可知，色譜斑點A在358 m/z左右的質荷比最高的分子離子峰為361.0，但是二芳基庚烷類化合物不含有氮原子，分子離子峰應當為偶數，361為奇數，所以該結果不成立。

色譜斑點B質譜圖見圖4。

圖4 色譜斑點B質譜圖

由圖4可知，362.0 m/z為該范圍內最高質量的離子峰。其分子離子峰滿足氮規則，二芳基庚烷類化合物中不包含氮原子，分子離子峰質量數應為偶數。最后需要判斷其與相鄰碎片離子（m/z較小者）之間的關系是否合理，分子離子峰與較小的碎片離子峰相減能否產生合理的碎片丟失（Δm），Δm=362.0-360.7≈1，表示該化合物在電子的轟擊下打掉了一個H，為合理丟失。362.0 m/z的離子峰符合這些條件。

色譜斑點C質譜圖見圖5。

圖5 色譜斑點C質譜圖

362.0 m/z與文獻中報道的數據358 m/z近似，所以色譜斑點B基本符合二芳基庚烷類化合物的質譜特征。

由圖5可知，C條帶在358 m/z左右的質荷比最高的分子離子峰為360.7，分子離子峰與較小的碎片離子峰相減能否產生合理的碎片丟失，Δm=360-353.3≈7，屬于不合理的碎片丟失。

色譜斑點D質譜圖見圖6。

由圖6可知，D條帶樣品最高分子離子峰為359.6，分子離子峰與較小的碎片離子峰相減能否產生合理的碎片丟失，Δm=359.6-349.2≈10，屬于不合理的碎片丟失。

圖6 色譜斑點D質譜圖

色譜斑點E質譜圖見圖7。

圖7 色譜斑點E質譜圖

由圖7可知，E條帶樣品在358 m/z左右并未出現明顯的離子峰，離子峰大多出現在了370 m/z以上的位置。與文獻所記載的數據有很大的偏差，不符合二芳基庚烷類化合物的特征。

2.4 紅外光譜檢測與分析

依次將色譜斑點A，B，C，D，E用色譜甲醇定容的溶液分別進行紅外光譜分析。根據文獻記載，二芳基庚烷類化合物紅外光譜多在3 300~3 500 cm-1，1 269 cm-1處有羥基的特征吸收峰，在2 931 cm-1和2 858 cm-1處有飽和CH伸縮振動的特征吸收峰，在1 708 cm-1處有羰基特征吸收峰，在1 600 cm-1處、1 500~1 550 cm-1有苯環的特征吸收峰，在1 070 cm-1處有醚鍵的特征吸收峰[8]。

色譜斑點A紅外圖譜見圖8。

由圖8可知，A條帶在3 000~3 500 cm-1有明顯的羥基峰，但是其他的特征峰與二芳基庚烷類化合物的紅外光譜特征峰吻合度并不高。

色譜斑點B紅外圖譜見圖9。

圖8 色譜斑點A紅外圖譜

圖9 色譜斑點B紅外圖譜

由圖9可知，色譜斑點B的紅外圖譜與文獻記載最為吻合。斑點B在3 382，1 289 cm-1處出現羥基的特征吸收峰；在2 955，2 925，2 856 cm-1處有飽和CH伸縮振動的特征吸收峰；在1 730 cm-1處有羰基特征吸收峰；在1 590 cm-1處有苯環的特征吸收峰；在1 073 cm-1處有醚鍵的特征吸收峰。故判定色譜斑點B可能為二芳基庚烷類化合物。

色譜斑點C紅外圖譜見圖10。

圖10 色譜斑點C紅外圖譜

由圖10可知，C條帶在3 200~3 500 cm-1處有羥基峰出現，但不具備二芳基庚烷類化合物的其他特征峰。

色譜斑點D紅外圖譜見圖11，色譜斑點E紅外圖譜見圖12。

由圖11和圖12可知，D與E條帶的紅外圖譜總體來說很相似，二者圖譜與二芳基庚烷類化合物的特征吸收峰相差甚遠，吻合度不高。

2.5 二芳基庚烷的旋光度、熔點

使用自動旋光儀對二號條帶進行旋光度和比旋度的測定。

核桃青皮中二芳基庚烷樣品的旋光度見表2。

圖11 色譜斑點D紅外圖譜

圖12 色譜斑點E紅外圖譜

表2 核桃青皮中二芳基庚烷樣品的旋光度

將3次試驗所得出的比旋度、旋光度數據取平均值。

平均比旋度=55.365+55.670+56.228/3≈55.754

平均旋光度=0.513+0.581+0.524/3≈0.539

將測量旋光度和比旋光度后的樣品進行結晶，放置入熔點儀中進行熔點的測定，熔點儀結果顯示為183℃。則可判定2號條帶的二芳基庚烷類化合物熔點為183℃。

3 結論

甲醇-水（3∶1）作提取劑，多級萃取結合微波超聲波組合輔助處理從核桃青皮中獲得乙酸乙酯提取液，提取率為1.6%。

核桃青皮樣液在優化試驗條件下，以苯∶乙酸乙酯（11∶1，V/V）為最佳展開劑，展開效果良好；GF254硅膠板在365 nm下，于GoodSsee-20E薄層成像系統中觀察效果良好，5個色譜斑點清晰。

在展開的5個色譜斑點中，色譜斑點B的分子質量（362.0 m/z）與相關文獻（358 m/z）相近，與相鄰碎片離子之間的關系合理Δm=362.0-360.7≈1）；在3 382，1 289 cm-1處出現羥基的特征吸收峰，2 955，2 925，2 856 cm-1處有飽和CH伸縮振動的特征吸收峰，1 730 cm-1處有羰基特征吸收峰，1 590 cm-1處有苯環的特征吸收峰，1 073 cm-1處有醚鍵的特征吸收峰；比旋度、旋光度、熔點分別為55.754，0.539，183℃。色譜斑點B與相關文獻報道基本相一致，可能是二芳基庚烷類化合物[9-15]。

超聲波微波組合萃取儀是集超聲波、微波、溫度等于一體的集合處理系統，對各個創新要素和創新內容進行選擇、集成和優化，形成優勢互補的有機整體的動態創新過程。采用了控制一定的溫度，優點是條件溫和、易于控制、提取率高、處理時間短，可提高提取率。

TLC分離、純化技術能適應不同物化特性的溶劑體系和多樣性的操作條件，具有較強的適應性，為從復雜的天然產物粗制品中提取不同特性（如不同極性）的有效成分提供了有利條件。其中，選擇展開劑不但要考慮到對所需成分有良好的溶解性，還要使各個成分之間分開，消除拖尾現象，選擇合適的展開劑對薄層色譜分離純化來講十分重要。

在紅外檢測時，有時候會出現樣品的特征峰與甲醇的特征峰相似的現象，初步推斷出現該問題的原因是甲醇添加過多，或可能檢測的物質含量過小，導致其特征峰被甲醇特征峰所掩蓋[16-20]。

質譜檢測時，存在其他多個碎片離子峰或者基峰，推測原因有3個：其一選擇的離子源不合適，導致打出的碎片雜多；其二在電轟擊過程中，產生了成倍的碎片離子峰；其三分離純化程度不夠，進入質譜的樣液尚存在雜質。

總之，TLC-CMS-IR聯用在生物活性物質分離純化中具有操作簡便、容易掌握、回收率高、重現性好、分離效率高、分離量較大等特點[21-23]，有望在標準品的制備、天然產物化學成分研究及新藥篩選、評價、分析或質控需求等領域得到更為廣泛的應用。