基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討復(fù)方蓯蓉益智膠囊治療阿爾茨海默病的機(jī)制研究

姚鳳紅，楊福生，苗 陽

（1.北京市中關(guān)村醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京100190；2.北京市中關(guān)村醫(yī)院醫(yī)務(wù)科；3.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院心內(nèi)科）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是老年人群中引起癡呆最常見的疾病，臨床上表現(xiàn)為近期記憶的減退，常常伴有行為、定向力和判斷等多種功能障礙，且進(jìn)行性加重，晚期會影響日常生活功能，出現(xiàn)嚴(yán)重的失能及失智。主要病理改變?yōu)榇竽X皮質(zhì)和海馬等處的以β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）為核心的細(xì)胞外老年斑（senile plaques，SP）和以異常磷酸化的Tau蛋白為核心的細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangle，NFT），同時還伴有神經(jīng)元和突觸的丟失等[1]。根據(jù)國際AD協(xié)會報道，預(yù)計到2050年全球AD患者將達(dá)到1.15億[2]。

目前臨床上治療AD的藥物主要是乙酰膽堿酯酶抑制劑、N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑、腦-腸軸調(diào)節(jié)的國產(chǎn)新藥甘露特納、Ca2+通道抑制劑及石杉堿甲。石杉堿甲作為我國的傳統(tǒng)藥物，近年來中藥成分的研究取得了顯著的成效，在治療阿爾茨海默病方面發(fā)揮著越來越重要的作用。復(fù)方蓯蓉益智膠囊是王永炎院士通過多年臨床實踐基礎(chǔ)上研發(fā)的，在北京、天津等多家醫(yī)院對AD患者治療后發(fā)現(xiàn)該中成藥能夠改患者[3～5]認(rèn)知功能。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的活性成分-作用靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)研究思路，探討復(fù)方蓯蓉益智膠囊核心組分與AD之間可能存在的相互關(guān)系，進(jìn)一步闡明該中成藥抗阿爾茨海默病的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 復(fù)方蓯蓉益智膠囊主要化學(xué)成分的獲取

從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫[5（]TCMSP，http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php）中檢索復(fù)方蓯蓉益智膠囊的中藥成分，該數(shù)據(jù)庫可獲得荷葉、肉蓯蓉和漏蘆這3種藥物的成分信息，其中制何首烏從已經(jīng)發(fā)表的CNKI文獻(xiàn)[6]和碩博士畢業(yè)論文數(shù)據(jù)庫[7]中查詢其主要的化學(xué)成分。地龍屬于動物類藥，由于其為異源蛋白，本研究舍棄了此種藥物成分的分析。

1.2 化學(xué)成分潛在作用靶標(biāo)庫的構(gòu)建

荷葉、肉蓯蓉和漏蘆使用TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢其主要的化學(xué)成分，通過口服生物利用度（oral bioavailabily，OB）≥30和類藥性（drug-like，DL）≥0.18進(jìn)行篩選，納入進(jìn)一步研究。制首烏的化學(xué)成分從文獻(xiàn)中獲得后，利用Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、化源網(wǎng)（https：//www.chemsrc.com/）等數(shù)據(jù)庫獲得化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)。大部分候選化合物的靶點可通過TCMSP檢索到，部分該庫沒有的靶點信息，利用化合物的SMILES作為檢索詞，通過SwissTargetPredictiong數(shù) 據(jù) 庫（http：//swisstargetprediction.ch/）預(yù)測靶點信息。獲得以上4種藥物的所有靶點信息后，去除掉所有的重復(fù)項，利用最新版Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），將所用的靶蛋白名稱轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)基因名，個別找不到對應(yīng)的條目去除掉。

1.3 疾病相關(guān)靶點庫的建立

疾病相關(guān)靶點通過關(guān)鍵詞“Alzheimer”在OMIM數(shù) 據(jù) 庫（Online Mendelian Inheritance in Man?，https：//www.omim.org/）進(jìn)行獲取。

1.4 靶點通路注釋分析

成分潛在靶點庫和AD疾病庫中的靶點之間進(jìn)行比對，獲得化合物-靶基因-AD疾病之間的共同靶點（交集基因）。蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建：共同靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），以“homo sapiens”作為唯一篩選參數(shù)，其余使用數(shù)據(jù)中的默認(rèn)值進(jìn)行獲取，得到蛋白的相互作用結(jié)果。輸出文件使用CytoscapeV 3.7.2對STRING的PPI進(jìn)行分析。交集基因?qū)隡etascape數(shù)據(jù)庫（https：//metascape.org/gp/index.html）進(jìn)行GO富集分析（gene ontology，GO）和KEGG通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 活性成分篩選

TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得荷葉的組分包含化合物為93個，肉蓯蓉為75個，漏蘆為25個，共193個，按照參數(shù)OB≥30%和DL≥0.18篩選，得24個化合物。制何首烏文獻(xiàn)中獲得10個化合物，一共入組34個化合物（見表1）。

2.2 活性成分的潛在靶標(biāo)和疾病相關(guān)靶基因

通過TCMSP和SwissTargetPredictiong數(shù)據(jù)庫獲得了以上34種活性化合物的潛在靶標(biāo)843個，經(jīng)過去重復(fù)處理后的得到了438個靶標(biāo)信息。對他們進(jìn)行Uniprot數(shù)據(jù)，獲得靶蛋白名稱和對應(yīng)基因名信息，最終得到425個靶標(biāo)結(jié)果。OMIM數(shù)據(jù)庫中獲得與AD相關(guān)的靶基因182個。兩個結(jié)果比對取之間的交集后，最終獲得了23個交集基因（見表2）。

表1 復(fù)方蓯蓉益智膠囊中4種藥物的主要化學(xué)成分

表2 活性成分-疾病相關(guān)靶標(biāo)信息

2.3 蛋白質(zhì)相互作用的注釋

STRING數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)，共獲得58個連接，平均節(jié)點度是5.04，PPI富集p值是7.12e-13。Cytoscape處理后的結(jié)果見圖1。其中每個節(jié)點（node）代表的蛋白，圖中圓圈部分，連接度（degree）大小以不同顏色和大小的node顯示。節(jié)點與節(jié)點之間的連接（edge）代表兩個蛋白之間的相互作用，combined score值的大小以線條粗細(xì)來凸顯出。其中依據(jù)連接度排名前5的基因為TNF（12），IL1B（11），VEGFA（11），CASP3（11）和NOS3（9）。

圖1 復(fù)方蓯蓉益智膠囊主要化學(xué)成分蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 作用通路注釋分析

Metascape數(shù)據(jù)庫中共得到667個GO富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果，依據(jù)默認(rèn)的參數(shù)進(jìn)行篩選，最終排名前20位的通路注釋結(jié)果見圖2。依次為調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平、AGE-RAGE信號通路（KEGG）、調(diào)節(jié)化學(xué)突觸傳遞、調(diào)節(jié)解剖結(jié)構(gòu)的大小、對有毒物質(zhì)的反應(yīng)、激素水平調(diào)節(jié)、體外凋亡信號通路、突觸傳遞的負(fù)調(diào)控、淀粉樣前體蛋白代謝過程等。

圖2 排名前20名的GO和KEGG通路富集分析

3 討論

關(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制，國際上提出眾多的假說，得到認(rèn)可的主要有β淀粉樣蛋白（Beta amyloid protein，Aβ）異常沉積、tau蛋白的過度磷酸化、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡以及腸道菌群失調(diào)等[8]。本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)復(fù)方蓯蓉益智囊主要活性成分34個，分別是：二苯乙烯苷類、蒽醌類及卵磷脂、環(huán)烯醚萜類、木脂素類、多糖、生物堿、槲皮素等。這些有效化學(xué)成分存在一對多、一對一及多對一作用特點。證實了復(fù)方蓯蓉益智膠囊確實具有多成分，多靶點協(xié)同的特性。檢索阿爾茨海默病的相關(guān)基因，與復(fù)方蓯蓉益智膠囊活性成分作用靶交集，得到23個交集基因，包括IL10、IL1B、CASP8、CASP3、TNF、VEGFA、CAV1、NOS3等，分別作用于神經(jīng)元細(xì)胞外淀粉樣前體蛋白（amyloid precusor protein，APP）的形成、氧化應(yīng)激、神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)以及凋亡等神經(jīng)元損傷通路。依據(jù)連接度排名前5的基因分別為TNF、IL1B、VEGFA、CASP3和NOS3，主要參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平、AGE-RAGE信號通路（KEGG）等。

在AD患者的腦內(nèi)，β-淀粉樣蛋白在細(xì)胞外大量聚集形成老年斑。在高糖狀態(tài)及老年體內(nèi)糖基化終產(chǎn)物（advaneed glycation end products，AGEs）及晚期糖化終產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end-products，RAGE）也明顯增加。近年來許多研究表明，AGEs的存在與AD、糖尿病關(guān)系密切[9～12]。Aβ的不斷增加，一方面通過RAGE下游信號通路激活氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等損傷途徑，激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放出炎癥介質(zhì)，如IL-1β[13]、IL-6、IL-18、TNF-α[14]等，引起局部的炎癥反應(yīng)；另一方面，Aβ-RAGE相互作用還能激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB），引起RAGE表達(dá)增加，從而激活A(yù)β介導(dǎo)的正反饋損傷效應(yīng)，加重Aβ毒性效應(yīng)[15]，最終加劇Aβ的沉積和老年斑的形成，進(jìn)而形成惡性循環(huán)。通過PPI分析，推測復(fù)方蓯蓉益智膠囊主要活性成分可能會降低RAGE表達(dá)、阻斷RAGE與Aβ結(jié)合的信號通路從而減輕AD患者炎性反應(yīng)損傷。

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種低氧誘導(dǎo)的分泌性蛋白質(zhì)，是調(diào)節(jié)血管功能的主要細(xì)胞因子，與內(nèi)皮細(xì)胞表面受體酪氨酸激酶結(jié)合促進(jìn)血管生成并參與血管重建；也可直接作用于神經(jīng)元，起到營養(yǎng)神經(jīng)和保護(hù)腦神經(jīng)元的作用；VEGF亦參與內(nèi)源性膽堿系統(tǒng)通路，在阿爾茨海默病等神經(jīng)變性病和腦血管病中起關(guān)鍵作用。CASP3全稱caspase3，是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者。通過特異性地裂解DNA依賴性蛋白激酶等，改變其結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Caspase3不僅在腦內(nèi)海馬區(qū)和皮層神經(jīng)元的凋亡過程中發(fā)揮效應(yīng)器的作用，而且還直接作用于阿爾茨海默病形成相關(guān)的APP等。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的NOS至少有三型包括神經(jīng)元型（nNOS或NOSI），誘導(dǎo)型（iNOS）和內(nèi)皮型（eNOS或NOS3），前兩種具有毒性作用，而來源于eNOS的NO具有神經(jīng)保護(hù)作用。上述研究結(jié)果提示復(fù)方蓯蓉益智膠囊可能通過參與血管重建、細(xì)胞凋亡來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，延緩AD病情進(jìn)展。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和信息工程學(xué)技術(shù)手段，建立復(fù)方蓯蓉益智膠囊活性成分-靶標(biāo)-阿爾茨海默病-信號通路分子生物網(wǎng)絡(luò)，探究復(fù)方蓯蓉益智膠囊治療AD的潛在機(jī)制，發(fā)現(xiàn)復(fù)方蓯蓉益智膠囊通過參與細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞保護(hù)、調(diào)節(jié)腦血供等途徑發(fā)揮延緩AD不可逆的病理進(jìn)展，為后續(xù)分子機(jī)制研究和實驗設(shè)計提供理論依據(jù)。