基于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)篩選動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的關(guān)鍵差異circRNA

李 晶,張 蕓＊，席建軍，程文俊，鴻嘎魯

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050）

1 前言

心血管疾病(cardiovascular disease，CVDs)是導(dǎo)致全球發(fā)病和死亡的重要原因，每年影響數(shù)百萬(wàn)人。動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種涉及不同細(xì)胞類型、多種細(xì)胞因子和粘附分子的慢性炎癥，不穩(wěn)定的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂、血管狹窄或血小板聚集和血栓形成引起的閉塞可導(dǎo)致急性心血管疾病[1，2]。氧化低密度脂蛋白（OxLDL）具有高度的致AS作用，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制與巨噬細(xì)胞攝取低密度脂蛋白后轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞密切相關(guān)[3]。因此，尋找與AS發(fā)展相關(guān)的生物標(biāo)志物可以為臨床研究提供理論依據(jù)。

環(huán)狀RNAs(circRNAs)是一類廣泛存在于各種生物細(xì)胞中具有調(diào)控基因表達(dá)功能的長(zhǎng)鏈內(nèi)源性非編碼RNA，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和組織特異表達(dá)等特征[4]，它們通常參與包括腫瘤在內(nèi)的各種疾病的發(fā)生和發(fā)展。大量的研究數(shù)據(jù)表明，circRNAs在多種腫瘤組織和癌旁正常組織中的表達(dá)存在顯著性的差異[5~9]。一些特異性表達(dá)的circRNAs可能成為腫瘤等多種疾病診斷和預(yù)后的新的生物標(biāo)志物。Chen L等人發(fā)現(xiàn)circRNA_100290可能作為一種競(jìng)爭(zhēng)性的內(nèi)源性RNA（ceRNA），通過(guò)吸收miR-29b家族成員來(lái)調(diào)控CDK6在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)[10]。盡管circRNAs在各種疾病中發(fā)揮作用，但是與AS相關(guān)的circRNAs的表達(dá)和功能鮮有研究，進(jìn)一步研究有望用于預(yù)防或治療AS。

在過(guò)去的幾十年中，微陣列技術(shù)和生物信息學(xué)分析被廣泛應(yīng)用于差異基因基因篩選。在我們的研究中，利用基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（gene expression omnibus，GEO）下載并分析微陣列數(shù)據(jù)集GSE107522，以獲得經(jīng)OxLDL處理得巨噬細(xì)胞THP-1實(shí)驗(yàn)組和THP-1對(duì)照組之間差異表達(dá)的circRNA(DEGs)。選擇hsa_circ_0003645作為研究基因，并通過(guò)CSCD數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)hsa_circ_0003645 open reading frame（ORF）、RNA binding protein(RBP)和microRNA response element(MRE)。隨后，對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)的通路富集分析，接著構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選關(guān)鍵基因，以幫助我們了解AS發(fā)展的分子機(jī)制，分析與關(guān)鍵基因相互作用的小分子藥物。本文探討了circRNAs可能成為AS的潛在標(biāo)志物，為預(yù)防和治療該疾病提供了理論基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 GEO數(shù)據(jù)下載和預(yù)處理

在GEO數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下載GSE107522數(shù)據(jù)集（3個(gè)巨噬細(xì)胞對(duì)照樣本，3個(gè)氧化型低密度脂蛋白(OxLDL)處理的巨噬細(xì)胞樣本）和GPL19978（Agilent-069978 Arraystar Human CircRNA microarray V1）平臺(tái)注釋文件，通過(guò)編寫perl腳本用平臺(tái)注釋文件對(duì)GSE107522表達(dá)矩陣的探針進(jìn)行注釋獲得circRNA表達(dá)矩陣，接著使用AgilentcircRNA注釋文件將circRNA的ID環(huán)化為circBase格式的ID。

2.2 差異分析

R軟 件（R version 3.6.1：https：//www.r-project.org/）加載limm包，以logFC>1或者logFC<1，P<0.05為篩選條件篩選差異表達(dá)的circRNA（DECs），接著利用pheatmap包對(duì)篩選出的DECs進(jìn)行熱圖繪制。在circBase（http：//www.circbase.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索DECs相關(guān)信息。接著在exorbase（http：//www.exorbase.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索DECs在外泌體中的表達(dá)水平。

2.3 CircRNAs的ORF、RBP和MER預(yù)測(cè)

通過(guò)CSCD[11]數(shù)據(jù)庫(kù)（Cancer-Specific CricRNA Database：http：//gb.whu.edu.cn/CSCD/）預(yù)測(cè)circRNAs的open reading frame（ORF）、RNA binding protein(RBP)和microRNA response element(MRE)。接著通過(guò)ORFfinder[7]數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）和circbank數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.circbank.cn/index.html）預(yù)測(cè)circRNA的OFR以及編碼的蛋白，并在UniProtKB數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)編碼的蛋白進(jìn)行blast分析。最后我們?cè)贑ircular RNA Interactome數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//circinteractome.nia.nih.gov/）預(yù)測(cè)circRNA的RBP，再 通 過(guò)venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在線網(wǎng)站與CSCD預(yù)測(cè)的RBP取交集。在starbase數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//starbase.sysu.edu.cn/）的通路模塊下對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)共有的RBP進(jìn)行KEGG富集分析。

2.4 CircRNA MER的靶基因預(yù)測(cè)及GO和KEGG pathway分析

下載miRDB、miRTarbase和TargetScan三個(gè)數(shù)據(jù)的miRNA靶基因預(yù)測(cè)文件，對(duì)通過(guò)perl腳本得到circRNAs MER在三個(gè)數(shù)據(jù)共同預(yù)測(cè)到的靶基因進(jìn)行GO和KEGG的富集分析。通過(guò)org.Hs.eg.db包將差異基因的Official Symbol轉(zhuǎn)化為基因ID，cluster-Profiler包進(jìn)行GO和KEGG富集分析，GO plot包[12]進(jìn)行聚類分析，且p值和q值都小于0.05才具有顯著差異。

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選

使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）構(gòu)建circRNA MER靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，并且綜合數(shù)值大于0.9的相互作用才具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的。Cyto-Hubba插件按degree方法篩選前20個(gè)關(guān)鍵基因。顏色越紅色代表基因degree越大。

2.6 關(guān)鍵基因的KEGG和GO富集分析

利用DAVID在線數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）進(jìn)行生物學(xué)分析，P值小于0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)Enrichr在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/)中的DrugMatrix分析預(yù)測(cè)可以與關(guān)鍵基因相互作用的小分子化合物。

3 結(jié)果

3.1 差異表達(dá)的circRNAs篩選

我們對(duì)GSE107522進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，得到了9個(gè)差異表達(dá)的DECs（見(jiàn)圖1A）和DECs繪制的熱圖（見(jiàn)圖1B）。與THP-1對(duì)照組相比，經(jīng)oxLDL處理得巨噬細(xì)胞THP-1中有8個(gè)circRNAs上調(diào)，1個(gè)circRNAs下調(diào)（見(jiàn)表1）。

為了從9個(gè)差異表達(dá)的circRNA篩選到目標(biāo)circRNA進(jìn)行后續(xù)分析，我們?cè)赾ircBase數(shù)據(jù)中檢索了這9個(gè)circRNA的相關(guān)信息。我們發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0003645和hsa_circ_0005699的基因名稱都是C16orf62且在許多樣本中都有表達(dá)（見(jiàn)表2）。有趣的是通過(guò)核酸序列比較發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0003645的核酸序列大于hsa_circ_0005699，因此我們選擇hsa_circ_0003645進(jìn)行后續(xù)分析。

3.2 CircRNA在人血外泌體中的表達(dá)水平

圖1 DECs的鑒定及circRNAs的表達(dá)Fig.1 Identification of DECS and expression of circRNAs

表1 circRNAs在oxLDL巨噬細(xì)胞吞噬中的差異表達(dá)Tab.1 Differential expression of circRNAs in phagocytosis of oxLDL macrophages

我們通過(guò)在exorbase（http：//www.exorbase.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索hsa_circ_0003645在人血外泌體中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)該circRNA在外泌體中有著比較高的表達(dá)水平，表達(dá)水平排在前10%~20%（expression ranK：10%~20%），且hsa_circ_0003645在冠心病和結(jié)腸癌患者血液外泌體中表達(dá)均下調(diào)（見(jiàn)圖1C）。這些結(jié)果表明，hsa_circ_0003645可能通過(guò)外泌體運(yùn)輸?shù)桨庹{(diào)控相關(guān)靶細(xì)胞，預(yù)示著巨噬細(xì)胞可能通過(guò)分泌外泌circRNA調(diào)控AS進(jìn)展。

3.3 CircRNA的ORF預(yù)測(cè)

通過(guò)CSCD在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)hsa_circ_0003645的ORF、RBP和MER（見(jiàn)圖2A）。通過(guò)ORFfinder數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)hsa_circ_0003645的ORF（見(jiàn)表3），結(jié)果顯示hsa_circ_0003645的ORF2可能編碼包含108個(gè)氨基酸的蛋白。對(duì)hsa_circ_0003645的ORF2相關(guān)蛋白進(jìn)行同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)錄該circRNA的VPS35L基因（C16orf62）編碼的蛋白同源性最高（見(jiàn)圖2B）。在circbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步驗(yàn)證hsa_circ_0003645的蛋白編碼能力，結(jié)果進(jìn)一步表明該circRNA具有較高的蛋白質(zhì)編碼能力（見(jiàn)圖2C）。

表2 差異表達(dá)的circRNA在circbase數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索信息Tab.2 Information retrieval of differentially expressed circRNA in circbase database

圖2 預(yù)測(cè)hsa_circ_0003645的蛋白編碼能力Fig.2 Forecasthsa_circ_Protein coding ability of 0003645

表3 has_circ_0003645的ORF預(yù)測(cè)Tab.3 has_circ_ORF prediction of 0003645

3.4 PBP預(yù)測(cè)與KEGG富集分析

我們通過(guò)CSCD數(shù)據(jù)庫(kù)和circRNAs Interactome數(shù)據(jù)庫(kù)共同對(duì)hsa_circ_0003645進(jìn)行RBP預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示hsa_circ_0003645含有eIF4AIII和TDP-43的結(jié)合位點(diǎn)（見(jiàn)表4）。為了解eIF4AIII和TDP-43的功能，我們通過(guò)starbase數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)eIF4AIII和TDP-43兩個(gè)RBP進(jìn)行KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)兩者都主要富集在Spliceosome、Cell_Cycle和Wnt_Signaling_Pathway等相關(guān)通路上（見(jiàn)表5、6）。

表4 circRNAs的RBP分析Tab.4 RBP analysis of circRNAs

表5 TDP-43在KEGG途徑中的富集分析Tab.5 Enrichment analysis of TDP-43 in KEGG pathway

表6 KEGG途徑中eIF4AIII靶標(biāo)的富集分析Tab.6 Enrichment analysis of eIF4AIII target in KEGG pathway

3.5 CircRNA MER靶基因預(yù)測(cè)及GO和KEGG pathway分析

同時(shí)，通過(guò)CSCD數(shù)據(jù)庫(kù)MER分析發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0003645與56個(gè)miRNA可能發(fā)生相互作用。通過(guò)perl腳本預(yù)測(cè)hsa_circ_0003645的MER在miRDB、miRTarbase和TargetScan三個(gè)數(shù)據(jù)中的共同靶基因，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0003645的MER含有578個(gè)靶基因，接著對(duì)這些靶基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。Go分析結(jié)果顯示（見(jiàn)圖3A）：BP主要富集在myeloid cell differentiation、response to steroid hormone、cellular response to steroid hormone stimulus。CC主要富集在cytoplasmic region、transport vesicle、secretory granule membrane。MF主要富集在DNA-binding transcription activator activity，RNA polymerase II-specific、hormone receptor binding、nuclear hormone receptor binding。并對(duì)GO富集結(jié)果進(jìn)行聚類分析。KEGG主要富集在Endocytosis、Focal adhesion、JAK-STAT signaling pathway、FoxO signaling pathway。并對(duì)KEGG富集結(jié)果進(jìn)行聚類分析。

圖3 GO和KEGG的富集分析Fig.3 Enrichment analysis of GOand KEGG

3.6 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選和分析

為確定目標(biāo)基因之間的關(guān)鍵基因，hsa_circ_0003645的靶基因通過(guò)STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖4A），然后通過(guò)Cytoscape軟件的NetworkAnalyzer plugin進(jìn)行分析靶基因（見(jiàn)圖4B），最后使用cytoHubba plugin的degree方法分析關(guān)鍵基因，排在前20的基因被鑒定為關(guān)鍵基因（見(jiàn)圖4C）。接著為了解這些關(guān)鍵基因的功能，我們通過(guò)DVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)hsa_circ_0003645的20個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0003645的20個(gè)關(guān)鍵基因的主要富集在protein ubiquitination、regulation of cell motility、cell periphery、FoxO signaling pathway、Focal adhesion、Wnt signaling pathway（見(jiàn)表7）。為了尋找與20個(gè)關(guān)鍵基因相互作用的小分子藥物，我們通過(guò)Enrichr數(shù)據(jù)庫(kù)的DrugMatrix分析，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0003645與新霉素、青霉素、氯雷他定三種小分子化合物相互作用（見(jiàn)表8）。這些結(jié)果表明這些小分子藥物可能具有治療動(dòng)脈粥樣硬化的潛在價(jià)值。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)和篩選關(guān)鍵基因Fig.4 PPInetwork and screening of key genes

表7 關(guān)鍵基因的GO和KEGG通路富集分析Tab.7 Enrichment analysis of key genes through GO and KEGG pathways

4 討論

心血管疾病(CVD)是當(dāng)代社會(huì)普遍存在的問(wèn)題。AS是導(dǎo)致人群心血管疾病(CVD)高死亡率的主要原因[13]。Liang Zong等人發(fā)現(xiàn)circRNA_102231在肺癌中表達(dá)上調(diào)，circRNA_102231沉默顯著降低了細(xì)胞遷移和侵襲的能力，抑制了細(xì)胞增殖[14]。然而circRNAs在AS中的作用還有待進(jìn)一步探討。

CircRNAs是一類在真核轉(zhuǎn)錄組中高度表達(dá)的非編碼RNA，可以作為miRNA海綿，從而降低其靶向mRNA的能力，還參與組織和器官的發(fā)育，并在各種疾病發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮作用[15]。Yan Zhang等人研究發(fā)現(xiàn)circRNA KIAA1586作為ceRNA吸收了三種miRNA(hsa-miR-29b、hsa-miR-101、hsa-miR-15a)，其失調(diào)可能導(dǎo)致阿爾茨海默癥相關(guān)生物學(xué)功能的異常[16]。Shen L等人研究發(fā)現(xiàn)circRNA 0044073在AS中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)靶向miR107和激活JAK/STAT信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲，可能為AS的治療策略提供新靶點(diǎn)[17]。這些研究結(jié)果有力地表明了circRNAs在多種疾病中起著重要作用。

表8 關(guān)鍵基因與16種小分子化合物相互作用分析Tab.8 Analysis of interaction between key genes and 16 small molecular compounds

本文研究通過(guò)微陣列數(shù)據(jù)集GSE107522獲得經(jīng)OxLDL處理的巨噬細(xì)胞THP-1實(shí)驗(yàn)組和THP-1對(duì)照組的DECs。我們發(fā)現(xiàn)共有9個(gè)差異表達(dá)的circRNAs，其中有8個(gè)表達(dá)上調(diào)，1個(gè)表達(dá)下調(diào)。結(jié)果顯示，單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞對(duì)oxLDL的吞噬作用以及隨后巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的分化是AS形成的關(guān)鍵。Chen L等人研究結(jié)果證實(shí)了circRNA_100290可作為治療人類口腔鱗癌的靶點(diǎn)[10]。因此，這些DECs有可能為AS提供潛在的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。我們根據(jù)circBase數(shù)據(jù)庫(kù)檢索9個(gè)差異表達(dá)的circRNA篩選出靶標(biāo)hsa_circ_0003645后，通過(guò)exorbase數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0003645在外泌體中的表達(dá)水平較高，且在CHD和CRC患者血液外泌體中表達(dá)均下調(diào)。而有研究表明由砷轉(zhuǎn)化的L-02細(xì)胞衍生出的外泌體circRNA_100284可通過(guò)充當(dāng)microRNA-217的海綿，加速細(xì)胞周期，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖[18]。因此，我們推測(cè)巨噬細(xì)胞可能通過(guò)分泌外泌circRNA調(diào)控AS進(jìn)展。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0003645有eIF4AIII和TDP-43的結(jié)合位點(diǎn)，可能與56個(gè)miRNA發(fā)生相互作用。circRNAs可能通過(guò)miRNAs調(diào)控靶基因發(fā)揮作用。He JH等人的研究結(jié)果表明circRNA-ACAP2可作為miR-21-5p的海綿，通過(guò)調(diào)控Tiam1的表達(dá)，從而影響結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[19]。此外，通過(guò)starbase數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)eIF4AIII和TDP-43兩個(gè)RBP進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)eIF4AIII和TDP-43兩者均主要在Spliceosome、Cell_Cycle和Wnt_Signaling_Pathway等相關(guān)通路中富集。由此，我們推測(cè)hsa_circ_0003645可能與eIF4AIII和TDP-43相互作用，從而調(diào)控動(dòng)AS相關(guān)功能。我們通過(guò)perl腳本預(yù)測(cè)hsa_circ_0003645的MER，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0003645的MER含有578個(gè)靶基因。有研究表明lncRNA和circRNA可作為ceRNA參與ceRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，可競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合相同miRNA，與mRNA之間相互作用，影響靶基因的翻譯或穩(wěn)定性，從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平的基因調(diào)節(jié)，進(jìn)而在腫瘤發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。有研究報(bào)道稱circRNA 0072088可以通過(guò)作為miR-377-5p的競(jìng)爭(zhēng)性ceRNA上調(diào)NOVA_2發(fā)揮作用，從而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖和遷移[20]。這與我們的研究類似，因此，我們判斷hsa_circ_0003645可能通過(guò)ceRNA的作用機(jī)制從而影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展進(jìn)程。隨后，我們通過(guò)對(duì)hsa_circ_0003645的靶基因構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并分析鑒定出20個(gè)關(guān)鍵基因，并對(duì)這20個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些關(guān)鍵基因主要富集在protein ubiquitination、regulation of cell motility、cell periphery、FoxO signaling pathway、Focal adhesion、Wnt signaling pathway。此外，我們通過(guò)Enrichr數(shù)據(jù)庫(kù)的DrugMatrix分析還發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0003645與新霉素、青霉素、氯雷他定三種小分子藥物相互作用，這些結(jié)果表明這些小分子藥物可能具有治療動(dòng)脈粥樣硬化的潛在價(jià)值。

總之，本文研究鑒定了hsa_circ_0003645及其相關(guān)的RBP和MER的分析。研究發(fā)現(xiàn)了20個(gè)關(guān)鍵基因以及與hsa_circ_0003645相互作用的3種小分子化合物。該項(xiàng)研究可能為AS提供新的生物標(biāo)記物以及具有潛在價(jià)值的小分子藥物。隨著基因測(cè)序技術(shù)的升級(jí)，越來(lái)越多的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)被建立，有許多在線數(shù)據(jù)庫(kù)可以用于circRNAs的研究，目前僅有少數(shù)circRNAs被證明與AS有關(guān)。然而，hsa_circ_0003645在AS形成過(guò)程中可能的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。此外，這些關(guān)鍵基因的生物學(xué)功能以及這些分子化合物在AS中的可能作用還需要進(jìn)一步研究。