NRP-1在皮膚黑色素瘤中的表達及對細胞增殖、凋亡的影響

洪小蘭，吳海麗，謝彩麗，沈翠蓉，錢 江

黑色素瘤(melanoma)是一種源于皮膚、黏膜、眼和中樞神經系統色素沉著區域的黑素細胞的惡性腫瘤，其惡性程度高，預后極差。超過95%的黑色素瘤發生在皮膚，稱為皮膚惡性黑瘤（malignant melanoma，MM）[1-2]。由于MM對化療或放療不敏感，Ⅳ期黑色素瘤患者的5年相對生存率顯著下降到10%[3-5]。因此，開發MM早期診斷及治療的新靶點對提高皮膚黑色素瘤患者預后具有十分重要的意義。近年來，隨著對皮膚黑色素瘤的深入研究，許多有效抑制MM生長和擴散的關鍵分子被鑒定出來，針對這些關鍵分子開發的靶向治療和免疫治療也取得了顯著的治療效果，預示了這一類藥物的應用前景[6-8]。

NRP-1是一種多功能的非酪氨酸激酶受體，可作為血管內皮生長因子（vascular endothelial growthfactor,VEGF）和軸突導向因子3(Semaphorin3,Sema3)的共受體，在血管生成，軸突引導，細胞存活，遷移和侵襲中發揮著多種作用[9-13]。相關研究提示，NRP-1在多種腫瘤組織中高表達，包括腦癌[14]，前列腺癌[15]，乳腺癌[16]，結腸癌[17]和肺癌[18]，并且NRP-1的表達水平與腫瘤進展呈正相關。然而，NRP-1在黑色素瘤中的表達及其作用的研究較少。本研究目的是探討NRP-1在4種人皮膚黑色素瘤細胞株中的表達及在人皮黑色素細胞瘤組織中的表達。此外，為進一步探討NRP-1對皮膚黑色素瘤的作用，本研究采用NRP-1單克隆抗體抑制NRP-1功能后探究NRP-1對皮膚黑色素瘤細胞增殖和凋亡作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株與細胞培養 人皮膚黑色素瘤細胞株SK-MEL-1，WM115，A-375，G361和人正常皮膚黑色素細胞株PIG1均購買于北京中源合聚生物科技公司。上述細胞均使用10%FBS和1%鏈霉素和青霉素的DMEM培養基于37℃，5%CO2的恒溫細胞培養箱培養。

1.2 主要試劑與材料 組織芯片（含6例人正常皮膚組織與12例皮膚黑色素瘤組織）購買于中科光華(西安)智能生物科技有限公司；鼠源性NRP-1單克隆抗體與β-actin單克隆抗體購買于廈門閩博生物技術有限公司；HRP標記兔抗鼠抗體購買于廈門慧嘉生物科技有限公司；CCK-8試劑盒、免疫組化染色試劑盒購買于上海生工生物工程股份有限公司；DMEM培養基（Thermo Fisher Scientific）；胎牛血清（GIBCO）；全蛋白提取試劑盒購買于上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 蛋白免疫印跡 （Western blot） 參考文獻報道的方法[19]，將處于指數生長期的細胞用細胞總蛋白提取試劑盒提取裂解，離心后收集上清液。加入4×上樣緩沖液煮沸5 min，于4℃條件下保存。采用12%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，電泳結束后將蛋白轉至PVDF膜上。室溫封閉（5%脫脂奶粉的TBS封閉液）1 h后，加入一抗4℃孵育過夜，用TBST洗3遍，每遍10 min，加入熒光標記二抗室溫孵育1 h，用TBST洗3遍后，滴加化學發光劑溶液（ECL）顯影液在顯影儀上進行顯影。

1.4 免疫組化染色與評分 免疫組化染色參考文獻報道的方法[20]，將石蠟切片至于60℃烘箱放置1 h后進行脫蠟、水化。脫蠟后，將浸入0.01 M枸櫞酸緩沖液（pH 6.0），置入微波爐中加熱10 min，進行抗原修復。進一步在組織切片上滴加3%過氧化氫溶液以阻斷內源性過氧化物酶。最后分別加入鼠源性NRP-1單克隆抗體（一抗）和HRP標記兔抗鼠抗體（二抗）進行孵育，最后用免疫組化試劑盒對切片進行染色處理。免疫組化評分采用積分綜合計量法，即NRP-1的表達指數=染色強度×染色細胞比例分數。

1.5 NRP-1單克隆抗體對皮膚黑色素瘤細胞增殖、凋亡的影響 取指數生長期的SK-MEL-1細胞稀釋至10×105/ml，轉移至12孔板于恒溫培養箱培養6 h。本研究將細胞進行以下分組并做相應處理，每組設置3個復孔：（1）空白對照組：不做任何處理；（2）低濃度抗體組：加入20μl的1μg/ml濃度的NRP-1單克隆抗體；（3）中濃度抗體組：加入20μl的500μg/ml濃度的NRP-1單克隆抗體；（4）高濃度抗體組：加入20μl的1 mg/ml濃度的NRP-1單克隆抗體；分別在6 h、12 h、24 h和48 h，利用CCK-8試劑盒對各濃度抗體處理組進行細胞計數，細胞相對增殖活性=抗體處理組細胞數/空白對照組細胞數 ×100%。參考上述的分組與處理，在培養48 h后采用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況。

1.6 統計學方法 應用SPSS22.0軟件進行數據處理和分析，計量資料以x±s表示，采用t檢驗，計數資料以例和百分率表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NRP-1在4種皮膚黑色素瘤細胞株中的表達Western blot結果顯示，NRP-1在4種人黑色素瘤細胞株（SK-MEL-1，WM115，A-375，G361）中的表達量均明顯高于人正常皮膚黑色素細胞株PIG1中的表達量（圖1），以內參蛋白β-actin為對照，對3次獨立實驗的Western blot結果做半定量分析，結果（表1）顯示，NRP-1在4種人黑色素瘤細胞株SKMEL-1，WM115，A-375和G361的相對表達量均較正常人皮膚黑色素細胞株PIG1高（P＜0.05）。其中，NRP-1在SK-MEL-1中的相對表達量最高，是在PIG1細胞株中的表達量的14.7倍。

2.2 NRP-1在皮膚黑色素瘤組織中的表達 含6例人正常皮膚組織與12例皮膚黑色素瘤組織的組織芯片的免疫組化結果見圖2，NRP-1在6例正常皮膚組織表達量較低或無表達；而在12例皮膚黑色素瘤組織中均能檢測到明顯的NRP-1表達，呈淺棕黃色或深褐色。

2.3 NRP-1單克隆抗體對皮膚黑色素瘤細胞增殖的影響 結果見圖3，低、中、高濃度組的細胞相對增殖活性均＜100%，即低、中、高濃度的NRP-1單克隆抗體均對細胞增殖有抑制作用。且隨著培養時間的增加，NRP-1對細胞增值的抑制效果越明顯。值得注意的是，NRP-1單克隆抗體處理48 h后，不同濃度抗體處理組的細胞相對增殖活性有顯著差異，表現為低濃度組的細胞相對增殖活性大于中濃度組的細胞相對增殖活性，中濃度組的細胞相對增殖活性大于高濃度組的細胞相對增殖活性，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 免疫組化檢測NRP-1在人正常皮膚組織與皮膚黑色素瘤組織中的表達（標尺=50μM）

2.4 NRP-1單克隆抗體對皮膚黑色素瘤細胞凋亡的影響 典型的流式細胞術結果見圖4A，NRP-1抗體組的凋亡（Q2區）細胞數明顯較PBS組多，且隨著NRP-1抗體濃度的增加，細胞凋亡數也隨之增加。對3次獨立實驗做定量分析，結果見圖4B，PBS組的細胞凋亡率為（1.43±0.15）%，低濃度組細胞凋亡率為 （5.57±1.44）%；中濃度組細胞凋亡率為（13.86±3.84）%， 高濃度組細胞凋亡率為（36.03±7.51）%。抗體處理組的細胞凋亡率均較PBS組高（P＜0.05）,且隨NRP-1單克隆抗體濃度的增加，細胞的凋亡率也隨之增加（P＜0.05）。

3 討論

皮膚黑色素瘤對常規的放療、化療均不敏感。近年來，隨著對皮膚黑色素瘤分子機制研究的深入，靶向治療和免疫治療已成為治療皮膚黑色素瘤的一種很有前途的治療方法。2014年，美國FDA批準了首個PD-1單克隆抗體用于晚期皮膚黑色素瘤的Ⅰ期臨床試驗。PD-1單克隆抗體的治療獲益率超過30%，晚期皮膚黑色素率的生存率明顯增加。1，2，3年生存率分別為62%、44%及40%[21]。 篩選可用于靶向治療或免疫治療的靶點是提高皮膚黑色素瘤患者預后的關鍵。NRP-1是一種很有前途的腫瘤治療靶點，被證實與多種腫瘤的不良預后相關，是近年來的一個研究熱點。

本研究首先利用Western blot檢測了4株人皮膚 黑 色 素 細 胞 瘤 細 胞 （SK-MEL-1，WM115，A-375，G361）和人正常皮膚黑色素細胞株PIG1細胞的表達情況。結果提示（圖1），NRP-1在人正常皮膚黑色素細胞中表達量較低。與正常皮膚黑色素細胞相比，4株黑色素細胞瘤細胞的NRP-1表達量均有不同程度的上調。其中，在SK-MEL-1和WM115細胞中表達最高。組織芯片的免疫組化結果（圖2）與Western blot檢測結果相符。在人正常皮膚組織中，NRP-1蛋白的表達量極低，幾乎檢測不到NRP-1的表達。而在人黑色素細胞瘤組織中均能檢測到NRP-1蛋白的高度表達。上述結果提示，NRP-1在皮膚黑色素瘤中的表達較正常皮膚組織有顯著上調。因此，NRP-1或是一個皮膚黑色素瘤診斷或治療的有潛力的分子靶標。接著，本課題初步研究NRP-1單克隆抑制NRP-1功能后對皮膚黑色素瘤細胞增殖和凋亡的作用。結果提示（圖3），NRP-1單克隆抗體能顯著抑制人皮膚黑色素細胞瘤SK-MEL-1細胞株的增殖。且這種細胞增殖抑制作用與抗體的濃度有關。進一步流式細胞術研究提示（圖4），NRP-1單克隆抗體也能促進SK-MEL-1細胞株的細胞凋亡。呂莎等[26]的研究提示，NRP-1單克隆抗體可通過PI3K/Akt和MEK/ERK1/2信號轉導途徑的活化來抑制細胞增殖和遷移，并通過Bcl-2/Bax/Caspase3途徑誘導細胞凋亡，從而發揮其抗腫瘤作用。該研究結果與本研究的相符。

圖1 Western blot檢測NRP-1在4種皮膚黑色素瘤細胞株中的表達

圖3 NRP-1單克隆抗體對皮膚黑色素瘤SK-ME-1細胞增殖的影響

圖4 NRP-1單克隆抗體對皮膚黑色素瘤細胞凋亡的影響

本研究初步確定了NRP-1在皮膚黑色素瘤中有高表達，且NRP-1單克隆抗體可顯著抑制皮膚黑色素瘤細胞的增殖、促進皮膚黑色素瘤細胞的凋亡。因此推測，NRP-1或是皮膚黑色素瘤的一個重要治療靶點。后期可深入探討NRP-1單克隆抗體抑制腫瘤細胞增殖和促進細胞凋亡的機制，或進一步在小鼠模型中評估NRP-1單克隆抗體在體內的腫瘤抑制作用。