NaHS對PD小鼠紋狀體的保護作用及對MMP-9和caspase-1表達的影響

肖 莉，李丹鳳，石清明，何 甜，李瀾芯，聶 政

帕金森病（Parkinson's disease,PD）是一種多因素的神經退行性疾病，PD的病理特征是黑質及紋狀體多巴胺（dopamin,DA）能神經元死亡和變性，其病因尚不清楚，除線粒體功能異常、氧化應激和α-synuclein蛋白的異常沉積外，神經炎癥反應已被證實可觸發和加重DA能神經元的變性[1-2]。基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)屬于基質金屬蛋白酶家族，MMP-9促進大腦炎性細胞（如小膠質細胞）的激活，而激活的炎性細胞又加重了DA能神經元的丟失[3-4]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1)與炎癥反應密切相關，caspase-1可以切割白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的前體，促進IL-1β 的成熟，IL-1β參與了帕金森病的發病過程[5-6]。硫氫化鈉(sodium hydrosulfide,NaHS)作為硫化氫(hydrogen sulfide,H2S)供體，在體內電離生成的HS-可與體內H+結合生成H2S，對1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)誘導的PD小鼠DA能神經元損傷產生保護作用[7-9]。但其保護作用是否通過抑制MMP-9和caspase-1介導的神經炎癥反應尚未明確。本研究通過構建小鼠PD模型，探討NaHS對PD小鼠紋狀體神經元的保護作用及其機制，對PD的治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級KM小鼠30只，18～20 g/只，購自成都達碩實驗動物有限公司。

1.1.2 主要試劑 NaHS（Sigma）；MPTP（aladdin）；羊抗兔IgG、GAPDH抗體（beyotime）；免疫組化試劑盒、caspase-1抗體、MMP-9抗體（boster）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及PD模型制備 將30只KM小鼠隨機分為病理組（MPTP組）、治療組（MPTP+NaHS組）和對照組（control組），每組10只。對3組小鼠進行腹腔注射給藥，病理組小鼠注射MPTP[30 mg/(kg·d)]，治療組先注射NaHS[3 mg/kg·d）]，0.5 h后再注射MPTP[30 mg/(kg·d）]，對照組注射0.9%的生理鹽水。 注射后觀察并記錄小鼠行為變化，連續注射1 w后取材。

1.2.2 取材 10%水合氯醛麻醉，開顱取腦分離紋狀體，免疫印跡法檢測MMP-9、caspase-1的表達。4%的多聚甲醛固定腦組織用于HE染色和免疫組織化學染色。

1.2.3 HE染色 常規石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察和比較各組小鼠紋狀體形態學改變。

1.2.4 免疫組化染色 采用SABC法進行MMP-9（1∶100）、caspase-1（1∶100）免疫組化染色，PBS代替一抗作陰性對照，10×40倍光鏡視野下隨機選擇5個視野，統計MMP-9、caspase-1陽性細胞數。

1.2.5 Western blot 取出紋狀體加入裂解液，充分研磨后，取上清，蛋白定量，電泳、轉膜、封閉，孵育抗體，最后曝光。測定各組小鼠紋狀體MMP-9（1∶1000）、caspase-1（1∶1000）蛋白表達的變化。

1.3 統計學方法 應用SPSS 21分析所得實驗數據，結果以x±s表示,各組均數比較采用單因素方差分析，組間差異比較采用SNK-q檢驗和Tamhane's t2檢驗。P＜0.05有顯著差異。

2 結果

2.1 小鼠的行為學改變 病理組第一次腹腔注射MPTP約0.5 h后，小鼠出現不同程度的呼吸急促、全身輕度抽搐、攻擊、豎尾、抓鼻等癥狀，癥狀持續約10 min后逐漸減輕直至消失，最后一次注射后，對照組小鼠行為正常；治療組出現上述癥狀明顯較輕；病理組小鼠均在數分鐘內產生上述癥狀。

2.2 HE染色結果 對照組紋狀體區域神經元形態正常，數量較多，排列整齊，間質清晰。病理組神經元數量減少，部分神經元變性壞死、胞體紅染、排列紊亂，膠質細胞增生。治療組神經元缺失、發生變性壞死及神經膠質細胞增生程度較病理組明顯減輕，見圖1（箭頭所示為壞死神經元）。

2.3 免疫組化檢測MMP-9表達 免疫組化結果顯示，MMP-9在小鼠腦組織紋狀體區域主要表達于神經元胞質中，呈棕黃色。對照組（1.60±0.89）個幾乎未見MMP-9陽性細胞，病理組MMP-9（32.2±3.63）個較對照組明顯增多（P＜0.05），但細胞總數（包括正常細胞）減少。與病理組比較，治療組（13.20±1.30）個MMP-9的表達減弱,陽性細胞數減少（P＜0.05），但細胞數量相對增加，見圖2（箭頭所示為MMP-9陽性細胞）。

2.4 免疫組化檢測caspase-1表達 結果顯示，caspase-1在小鼠腦組織紋狀體區域主要表達于神經元胞質中，呈棕黃色。對照組陽性細胞數為（2.20±1.48）個，幾乎未見caspase-1陽性細胞，病理組caspase-1陽性細胞數為（27.40±1.52）個，較對照組明顯增多（P＜0.05），但細胞總數（包括正常細胞）減少。與病理組比較，治療組為（14.20±0.84）個，MMP-9的表達減弱，陽性細胞數減少（P＜0.05），但細胞數量相對增加，見圖3（箭頭所示為caspase-1陽性細胞）。

2.5 Western blot檢測MMP-9和caspase-1的表達Western blot結果對應位置出現目標蛋白（圖4）。MMP-9結果MPTP處理后，與對照組0.25±0.13相比，MPTP組1.17±0.17的表達量明顯增高（P＜0.05）。NaHS處理后，MPTP+NaHS組0.56±0.22蛋白表達量較MPTP組減少（P＜0.05）。Caspase-1檢測結果顯示，MPTP處理后，MPTP組1.15±0.03的蛋白量較對照組0.32±0.11明顯增高（P＜0.05）。NaHS處理后，MPTP+NaHS組0.63±0.14蛋白表達量較MPTP組減少（P＜0.05）。

3 討論

PD的病理特征是黑質及紋狀體的DA能神經元死亡變性，其損傷的原因尚未完全清楚，近年來，除了線粒體功能異常、氧化應激和α-synuclein蛋白的異常沉積外，神經炎癥也參與了PD的發病機制[10-11]。炎癥反應可修復和清除機體有害物質，神經炎癥反應也本應如此，但由于神經元一旦損傷便不可修復再生。所以，過度的神經炎癥反應抑制神經元再生，也是引發PD及其他神經變性疾病的關鍵[11]。 紋狀體的血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)對刺激具有高反應性，MPTP可能誘導TNF-α和IL-1β增多，使紋狀體的BBB通透性增加，紋狀體DA能神經元丟失更加嚴重[12-13]。

MMP-9是一類由免疫細胞分泌的蛋白酶，遍及機體各種組織器官，降解和重塑細胞外基質。在中樞神經系統中，MMP-9雖然也可在正常人腦中被檢測到，但其表達處于基礎水平。但在病理條件下，如當PD發生后，其表達大量增加。MPTP的代謝產物MPP+可使DA能神經元變性，激活小膠質細胞，上調紋狀體MMP-9的活性[14-15]。Annese等[4]也證實，在注射MPTP后，黑質和紋狀體MMP-9含量增加，MMP-9激活IL-1β和TNF-α等炎性介質，促進膠質細胞的遷移和降解細胞外基質蛋白，增加BBB的通透性。在BBB血管側的內皮細胞之間有提供結構完整性的復合物，包括緊密連接[16]。MMP-9破壞緊密連接，使BBB的作用被削弱，加重神經元丟失，同時炎性細胞向腦內的遷移加重神經元變性[7]。Caspase家族已被公認參與PD病理過程，加重DA能神經元的死亡，小膠質細胞因此活化，從而誘發caspase-1釋放成熟的IL-1β和IL-18，這些炎癥介質進一步加重DA能神經元的變性和MMP-9的釋放[15,17]。因此，caspase-1誘導小膠質細胞介導的神經炎癥，加重PD[18-19]。

圖1 紋狀體區域的病理學變化（×400）

圖2 紋狀體MMP-9免疫組織化學結果（×400）

圖3 紋狀體caspase-1免疫組織化學結果（×400）

圖4 紋狀體MMP-9、caspase-1的蛋白水平

H2S是一種氣體遞質，在調節哺乳動物生物事件中發揮重要病理生理作用，可以抗炎，抑制氧化應激，作為神經調節劑調節神經遞質[20]。NaHS可以作為H2S的供體，使神經元免受MPP＋誘導的細胞毒性反應和細胞凋亡[21]。本研究通過建立小鼠PD病理模型，行為學改變提示NaHS預處理組能明顯改善MPTP所致的PD小鼠出現不同程度的呼吸急促、驚厥、攻擊、豎尾等癥狀。HE染色結果顯示病理組神經元數量減少、排列紊亂、部分神經元壞死及周圍見膠質細胞增生。NaHS預處理組神經元變性、丟失和神經元排列紊亂程度較病理組明顯減輕。說明NaHS預處理組對PD小鼠紋狀體神經元具有保護作用。各組小鼠大腦紋狀體區域MMP-9及caspase-1主要表達于神經元胞質中，免疫組化和WB結果顯示NaHS預處理組能顯著抑制PD小鼠紋狀體神經元MMP-9的表達。此結果說明NaHS可能通過抑制MMP-9的表達，減少炎性介質的釋放、抑制炎性細胞向腦內的遷移浸潤和細胞外基質蛋白降解有關。免疫組化和WB結果顯示NaHS預處理組也可顯著降低PD小鼠紋狀體神經元caspase-1的表達。說明NaHS可能通過下調caspase-1的表達，減少IL-1β和IL-18等炎癥介質的釋放，從而減輕紋狀體神經元的損傷。

綜上所述，NaHS對MPTP所致PD小鼠紋狀體具有保護作用。此作用可能通過抑制caspase-1的激活從而減少IL-1β和IL-18等炎癥介質的釋放，下調下游的MMP-9，對神經系統的炎癥反應起到緩解作用，從而減少紋狀體區DA能神經元變性和丟失有關。