循環血外泌體miR-320對NSTEMI的鑒別診斷價值研究

楊 濛，丁 輝

急性冠脈綜合征是目前我國居民死亡和影響傷殘調整生命年的首位原因，且隨著人口老齡化其對傷殘調整生命年的影響還在逐年上升[1]。急性冠脈綜合征的診斷主要從癥狀、心電圖及心肌損傷標志物三方面考慮，而非ST段抬高心肌梗死（NSTEMI）由于沒有典型心電圖表現診斷更為困難[2]，目前高敏心肌肌鈣蛋白（hs-cTnI）為NSTEMI唯一推薦的血清學診斷標志物，但由于其與心肌損傷相關，除心肌梗死外，在心肌炎、心包炎、肺栓塞等多種疾病中也可升高，診斷特異度欠佳，仍有待開發針對NSTEMI的特異性標志物[3]。外泌體是直徑30～150 nm的細胞外囊泡，由于其中可裝載各種細胞內組分如蛋白質、RNA、脂質已成為多種疾病的候選診斷標志物[4-6]，通過對NSTEMI患者外周血外泌體的篩選筆者發現微小RNA miR-320的表達上調，本研究將進一步探討循環血外泌體miR-320對NSTEMI的鑒別診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 連續納入2017年1月～2019年7月醫院收治的NSTEMI患者112例作為觀察組訓練集，同期納入非心肌梗死患者37例作為對照組，其中病毒性心肌炎12例，急性肺栓塞25例；納入2019年8月～2020年12月醫院收治的NSTEMI患者75例作為觀察組測試集，同期納入非心肌梗死患者21例作為對照組，其中病毒性心肌炎9例，急性肺栓塞12例。所有患者入院后收集年齡、性別、BMI、血脂情況、高血壓及糖尿病史、肝腎功能、凝血功能及心肌損傷標志物水平。

1.2 納入與排除標準 觀察組納入標準：（1）有典型癥狀及心電圖改變或有缺血性胸痛病史；（2）年齡≥18歲；（3）發病時間12～24 h；（4）冠狀動脈造影顯示心電圖缺血導聯對應的冠脈管腔狹窄≥50%，符合上述全部選項者納入本研究。對照組納入標準：（1）出現典型癥狀及心電圖改變；（2）年齡≥18歲；（3）發病時間12～24 h；（4）3 w內有病毒感染癥狀，如乏力、發熱、頭痛等；（5）CT肺動脈造影確診為急性肺栓塞。排除標準：（1）冠狀動脈痙攣、心肌橋、冠狀動脈畸形以及繼發因素導致的急性心肌梗死患者；（2）合并甲亢、貧血等代謝性疾病；（4）妊娠期婦女；（5）合并急慢性感染；（6）心源性休克；（7）合并嚴重肝腎功能不全；（8）臨床數據不完整，依從性差。符合上述任1選項者不納入本研究。本研究已上報醫院倫理委員會批準。

1.3 外周血外泌體提取與鑒定 患者入院時抽取5 ml外周靜脈血，在4℃下500 r/min離心15 min后收集血清，使用exoRNeasy Serum/Plasma Midi試劑盒（中國上海，Qiagen公司，貨號77044）和超速離心（中國上海，Beckman公司，Optima TM L-80 XP）120 000 r/min離心80 min提取外泌體，剩余血漿用PBS（1∶1）稀釋用作對照，通過ZetaviewTM納米生物顆粒分析儀對外泌體的布朗運動進行追蹤和分析，結合Stockers-Eiustein方程計算外泌體的流體力學直徑和濃度。

1.4 總RNA提取及逆轉錄 將RNeasy MinElute離心柱放入1.5 ml收集管中，在離心柱膜中央加入14μl無核酶水，靜置1 min，然后25℃下5000 r/min離心1 min洗脫總RNA，超微量分光光度計（中國上海，賽默飛世爾科技有限公司，貨號NanoDrop2000）測定總RNA濃度及純度。取RNA 0.5μg使用SuperScriptTMⅢ逆轉錄試劑盒(中國上海,賽默飛公司,貨號18080044)合成miRNA的互補DNA。逆轉錄反應條件：16℃30 min，42℃30 min，85℃5 min，莖環引物序列：5'-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA GTG AA-3'。

1.5 實時熒光定量PCR 使用TransStartRTop Green qPCR SuperMix試劑盒(中國北京，全式金生物技術有限公司,貨號AQ132-21)對miR-320進行實時熒光定量PCR，PCR反應在LightCycler480Ⅱ實時熒光定量PCR系統(中國上海，羅氏公司)上進行，以U6作為內參，正向引物：5'-GCA CTT TAT TGG TCC ATC ATC C-3'； 反 向 引 物 ：5'-GAC ACC TGG CTC TTT TTG ATT C-3'。PCR反應條件：95℃預變性3 min，95℃變性15 s，58℃退火30s，72℃延伸30 s，40個循環后通過Ct值，即熒光強度達到給定閾值時所需的循環數并計算2-△△CT來定量microRNA的表達，miR-320正向引物：5'-ACA CTC C AG CTG GGA AAA GCT GGG TTG AGA-3'；反向引物：5'-TGG TGT CGT GGA GTCG-3'。

1.6 統計學方法 應用SPSS 19.0軟件進行統計學處理。計量資料以均數±標準差表示，比較采用t檢驗；計數資料以例和百分率表示，比較采用χ2檢驗；使用皮爾遜線性相關分析兩計量資料間的相關性；使用受試者工作特征曲線（ROC）及其曲線下面積（area under the curve,AUC）評估診斷效能，ROC之間比較采用Z檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象基線資料 觀察組BMI、血脂異常比例、hs-cTnI、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶及血清miR-320相對表達量均高于對照組，D二聚體水平低于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

2.2 miR-320與hs-TnI水平的相關性 觀察組miR-320表達量與hs-TnI水平相關系數為0.831(95%可信區間0.782～0.871，P＜0.001）， 對照組miR-320表達量與hs-TnI水平相關系數為0.383(95%可信區間0.138～0.583，P＜0.01），見圖1。

2.3 訓練集中miR-320及hs-cTnI的診斷效能miR-320診斷NSTEMI的AUC值為0.899(95%可信區間0.839～0.943），高于hs-cTnI的0.739(95%可信區間0.661～0.808)，差異有統計學意義（Z=3.100，P＜0.01），見圖2。根據ROC曲線確定的miR-320和hs-cTnI最佳靈敏度和特異度下截斷值分別為1.14和0.18 ng/ml。miR-320診斷NSTEMI的靈敏度、特異度、陽性似然比、陰性似然比及正確指數分別為79.4%、91.9%、9.80、0.22、0.64；hs-cTnI診斷NSTEMI的靈敏度、特異度、陽性似然比、陰性似然比及正確指數分別為73.2%、70.3%、2.46、0.38、0.43。

2.4 miR-320及hs-cTnI的診斷效能測試miR-320診斷NSTEMI的AUC值為0.876(95%可信區間0.792～0.934），高于hs-cTnI的0.778(95%可信區間0.681～0.856)，差異有統計學意義（Z=2.639，P=0.032），見圖3。使用訓練集miR-320最佳截斷值miR-320診斷NSTEMI的靈敏度、特異度、陽性似然比、陰性似然比及正確指數分別為73.3%、90.5%、7.70、0.29、0.64；hs-cTnI診斷NSTEMI的靈敏度、特異度、陽性似然比、陰性似然比及正確指數分別為42.7%、95.2%、8.96、0.60、0.38。

表1 研究對象基線資料比較

圖1 miR-320與hs-TnI水平的相關性

圖2 miR-320及hs-TnI診斷NSTEMI的ROC曲線

圖3 測試集ROC曲線

3 討論

hs-TnI診斷NSTEMI的內部真實性已得到了充分的驗證，其區分NSTEMI與不穩定心絞痛的特異度和敏感度均達90%以上[7]，然而，對于其外部真實性如與心肌損傷相關疾病的鑒別診斷效能仍未得到充分證實，目前已有文獻報道hs-TnI也會受到其他心臟疾病如心肌炎、心包炎、主動脈夾層，免疫性疾病如系統性紅斑狼瘡以及尿毒癥、膿毒癥等諸多疾病的干擾[8]，其中病毒性心肌炎及肺栓塞由于與NSTEMI癥狀相似極易誤診，因此人們重點關注病毒性心肌炎及肺栓塞與NSTEMI的鑒別診斷。

從基線資料來看，觀察組BMI、血脂異常比例均高于對照組，這在于兩者均為NSTEMI發病的重要危險因素，而hs-cTnI、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶作為心肌損傷標志物同樣在NSTEMI組中升高，D二聚體水平作為提示肺栓塞的重要標志物，其在對照組中升高與臨床經驗相符。更重要的是，觀察組miR-320相對表達量高于對照組，這與本研究預試驗的結果一致，先前Zhang等[9]的研究指出miR-320在缺氧缺糖/復氧復糖心肌細胞模型中發揮誘導損傷的作用，Li等[10]的研究則發現miR-320可加劇高血糖引起的心臟功能障礙，類似Yang等[11]的研究指出miR-320可拮抗胰島素介導的心臟保護作用，這些結果均提示miR-320在缺血性心臟病中的上調是其病理生理過程中重要的環節，此外，根據這些研究的結果miR-320對心肌損傷的介導作涉及多種轉錄因子、非編碼RNA及PI3K/Akt/mTOR信號通路等與hs-TnI不同的分子及信號轉導過程，這可能是其表現出相比hs-TnI更具鑒別診斷價值的細胞生物學基礎。

盡管miR-320在心肌損傷中的作用已有少量文獻報道，但其在臨床樣本尤其是外周血外泌體中的表達尚未見研究報道，事實上外泌體發揮著載體及膜屏障的作用從而富集并且保護微小RNA免受免疫系統攻擊，因此從其已成為檢測外周血微小RNA表達的重要媒介[12]。目前已報道有數種外泌體微小RNA如miR-21、miR-183、miR-204有潛在的心肌梗死診斷及病情監測價值[13-15]，本研究結果顯示miR-320在NSTEMI與病毒性心肌炎和肺栓塞的鑒別診斷中有著高于hs-cTnI的診斷效能，在訓練集和測試集中hs-cTnI診斷特異度存在較大波動，說明其在此類鑒別診斷患者中易受到患者個體差異的影響，易出現假陽性，而miR-320與其相比效能更為穩定且有效彌補了其診斷特異度上的不足，有助于排除假陽性患者，而從相關性分析結果來看兩者在觀察組患者中具有較好相關性但在對照組中相關性欠佳，這可能在于病毒性心肌炎和肺栓塞與心肌梗死在病理生理機制上的差異，病毒性心肌炎心肌損傷的機制主要來自于機體對病毒的異常免疫應答，而肺栓塞導致hs-cTnI升高的原因可能在于繼發于肺動脈阻力增加的急性右心室應激及通氣-灌流失衡，未來對miR-320介導心肌損傷機制研究的進展將有助于揭示這些結果的內在原因。

本研究主要不足指之處在于受本中心臨床病例的限制，盡管設計了訓練集及測試集探討miR-320的診斷價值，但未能安排驗證集，后續研究有必要納入其他中心病例作為外部驗證，此外，各指南及文獻均指出hs-TnI在腎功能不全患者中診斷效能受到極大限制[16]，而miR-320是否能改善這一缺陷有待后續研究進一步探討，最后，臨床中偶可出現肺栓塞與心肌梗死并發的病例如Leriche綜合征，極易造成漏診[17]，由于受到樣本量限制對此類患者的診斷有賴于進一步研究跟進。

綜上所述，循環血外泌體miR-320能有效區分NSTEMI與病毒性心肌炎和急性肺栓塞患者，對NSTEMI的鑒別診斷有較好應用前景。