山藥茯苓復合酵素的發酵工藝優化及其發酵前后總多糖含量對比分析

劉 斌，饒 智，李俊明，吳 鈺，謝夢洲

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南省藥食同源功能性食品工程技術研究中心，湖南長沙 410208）

酵素是指選取一種或多種新鮮水果、蔬菜、食用菌、中草藥為基礎原料，經乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等多種有益菌發酵而使原材料生物活性增強或產生新的生物活性的物質[1]。關于酵素的研究最早在20世紀初起源于日本，后來發展到歐美和我國臺灣地區，成為了相當成熟的產業，有上千萬消費者每天服用酵素產品[2]。近30年來，中國人的血脂水平逐步升高，血脂異常患病率明顯增加。2012年全國調查結果顯示[3]，中國成人血脂異常總體患病率高達40.40%，較2002年呈大幅度上升[4]。高脂血癥是導致動脈粥樣硬化進而形成心腦血管事件的主要因素之一，有效防治血脂異常是預防心腦血管疾病的重要途徑[5]。目前，市面上流通的治療藥物對肝臟有一定損害及副作用，故不適合長期服用，患者順應性差。因此，選取藥食同源中藥，開發具有防治高脂血癥的保健食品具有廣闊的市場前景和重要的社會科學意義。

山藥甘、平，歸脾、肺、腎經，有益氣養陰、補脾肺腎、固精止帶的功效。藥理試驗數據表明，山藥多糖具有有效調節糖尿病小鼠糖脂代謝紊亂的作用[6]，可降低糖尿病小鼠體內血糖（GLU）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的濃度，緩解體重減輕的狀況。茯苓甘、淡、平，歸心、脾、腎經，有利水滲濕、健脾、寧心的功效。茯苓有很好的利尿作用，健康人服用茯苓水煎劑，有明顯的利水效果；對心源性水腫患者的利水效果非常好，日劑量100 g時效果最好[7]。目前，關于具有降血脂功能的藥食同源中藥酵素的研究鮮有報道。試驗以山藥[8]、茯苓[9]等5味藥食同源中藥為主要原料[10]，植物乳酸桿菌為發酵菌種，通過正交設計試驗優化水提工藝及發酵工藝，總多糖含量和干浸膏得率為評價指標，采用紫外分光光度法、苯酚-硫酸顯色測定總多糖的百分含量，從而為山藥茯苓復合酵素飲料開發成降血脂的功能性食品提供科學依據[11]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山藥飲片，產地河南；茯苓飲片，產地湖南；植物乳酸桿菌CICC21790，中國工業微生物菌種保藏管理中心提供；MRS肉湯培養基BS1137，杭州百思生物技術有限公司提供；無水葡萄糖對照品，上海沃凱生物技術有限公司提供（批號：20080415）；苯酚，廣東光華科技股份有限公司提供（批號：20160701）；硫酸，株洲市星空化玻有限責任公司有限公司提供（批號：20171120）；乙醇，上海沃凱生物技術有限公司提供（批號：20180413）；實驗室用水為純化水，試劑均為分析醇。

1.2 儀器與設備

UV900B型紫外可見分光光度計，北京萊伯泰科產品；ATX124型電子天平，東京島津儀器有限公司產品；HY-4型調速多用振蕩器，常州榮華儀器制造有限公司產品；DIKW-S-6型電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫療儀器產品；KM5200DE型超聲波清洗器，昆山美美超聲儀器產品；N-301010L型旋轉蒸發器，日本東京理化產品；SCIENTZ-10N型冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份產品；SFY-20BL型水分測定儀，深圳市冠亞水分儀科技產品；HNYC-203T型智能恒溫培養振蕩器，天津歐諾儀器股份有限公司產品；TGL18W型高速冷凍離心機，長沙英泰儀器有限公司產品。

2 試驗方法與結果分析

2.1 總多糖百分含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取經105℃干燥至恒質量的無水葡萄糖對照品20.4 mg，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.204 mg/mL無水葡萄糖對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

取各正交設計試驗得到的水提物和發酵制得的干浸膏約0.5 g，加入80%乙醇100 mL先研磨，使之分散成混懸水溶液，再轉移至三角瓶中，加熱回流1.0 h，趁熱濾過，濾渣與濾器用熱80%乙醇30 mL分次洗滌，棄去濾液，濾渣連同濾紙置燒瓶中，加水150 mL，加熱回流1.0 h，趁熱濾過，同上操作，再重復提取1次[12]。用少量熱水洗滌濾器，合并濾液與洗液，放冷，轉移至500 mL量瓶中，用純化水稀釋至刻度，搖勻[13]。

2.1.3 標準曲線的繪制

精密量取對照品溶液0，0.1，0.2，0.4，0.7，1.0 mL，分別置于10 mL具塞刻度試管中，再分別加水補至2.0 mL，各精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入硫酸7 mL，密封；用調速多用振蕩器混勻，放置10 min，置40℃水浴中保溫15 min，取出，迅速冷卻至室溫，于波長490 nm處測定吸光度，繪制標準曲線，得線性回歸方程Y=0.037 8X+0.024 7，線性相關系數R=0.999 5，結果表明葡萄糖質量濃度在0～20.4μg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.4 供試品溶液的測定方法

精密移取制備的供試品溶液1 mL，置于10 mL具塞刻度試管中，加水補至2.0 mL；精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸7 mL，密封；用調速多用振蕩器混勻，放置10 min，置于40℃水浴中保溫15 min，取出，迅速冷卻至室溫，于波長490 nm處測定吸光度，根據標準曲線線性回歸方程計算總多糖百分含量[14]。

2.2 山藥、茯苓水提取物制備工藝優化

2.2.1 山藥、茯苓水提取物制備的基本工藝

按處方比例稱取山藥、茯苓等5味中藥飲片，加一定量純化水超聲浸泡一定時間，在一定的水浴溫度下加熱回流一定時間[15-16]，過濾；濾渣第二次加一定量純化水，在一定的水浴溫度下加熱回流一定時間，過濾；合并2次濾液，用旋轉蒸發儀在50℃，30 r/min，30 kPa的條件下減壓濃縮至藥材：濃縮液=1∶1左右，再冷凍干燥成干浸膏粉（含水量＜5.0%）。

2.2.2 山藥、茯苓水提取工藝正交設計試驗

取山藥、茯苓共9份，每份按照正交設計試驗因素水平表（表1）進行水提物（干浸膏）的制備，測定干浸膏得率[17]及總多糖含量。

水提取工藝因素與水平設計見表1，水提正交設計試驗總多糖百分含量及干浸膏得率測定結果見表2，水提正交設計試驗總多糖及干浸膏得率因素間方差分析見表3，水提正交設計試驗總多糖百分含量及干浸膏得率各因素的水平間方差分析見表4。

表1 水提取工藝因素與水平設計

表2 水提正交設計試驗總多糖百分含量及干浸膏得率測定結果

表3 水提正交設計試驗總多糖百分含量及干浸膏得率因素間方差分析

表4 水提正交設計試驗總多糖百分含量及干浸膏得率各因素的水平間方差分析

以總多糖百分含量為評價指標：A因素水平間差別皆具有統計意義，取A因素的1水平，即水提溫度95℃，B、C、D因素可任意取值；以干浸膏得率為評價指標：A因素水平間差別皆具有統計意義，取A因素的1水平，即水提溫度95℃，B因素水平間差別皆具有統計意義，取2水平或3水平，因2水平加水量少于3水平，故B因素取2水平，即加水量第1次為12倍，第2次為10倍。C因素水平間差別皆具有統計意義，取2水平或3水平，因2水平提取時間短于3水平，故C因素取2水平，即提取時間第1次為2.0 h，第2次為1.5 h。D因素可取任意值，因1水平超聲浸泡時間最短，故D因素取1水平，即超聲浸泡時間為0.5 h。

2.2.3 水提取工藝驗證試驗結果

對水提工藝所得到的優化工藝參數進行驗證試驗，取3批山藥及茯苓飲片，每批總量1.0 kg，加純化水量為藥材量的12，10倍，超聲浸泡時間為0.5 h，水提溫度95℃，水提取時間為2.0，1.5 h，測得總多糖含量為8.796%，RSD=1.957%（n=3），干浸膏得率為7.514%，RSD=1.745%，驗證結果略高于正交設計試驗中的最高值，表明該工藝科學、合理、穩定、可行。

2.3 山藥、茯苓復合酵素的發酵工藝優化

2.3.1 山藥、茯苓復合酵素的發酵基本工藝

2.3.2 菌種的培養與分離

培養植物乳酸桿菌（MRS肉湯培養基，接種量0.1%，37℃，180 r/min振蕩培養）至對數生長中后期，然后4℃條件下以轉速10 000 r/min離心10 min棄上清液取菌體，無菌生理鹽水洗滌菌體2次（重懸菌體后離心棄上清液），再加純化水制成混懸液以備接種[18]。

2.3.3 山藥、茯苓復合酵素的發酵工藝優化

（1）山藥、茯苓復合酵素的發酵工藝正交設計試驗。選取對發酵工藝影響較大的接種量、發酵溫度、發酵時間3個因素進行考查，按干浸膏混懸水溶液體積的5%，10%，15%加入菌液進行發酵[19]，發酵液靜置澄清2 h后，取上清液以轉速8 000 r/min離心10 min，將上清液用0.45μm濾膜過濾，即得山藥茯苓復合酵素水溶液，再冷凍干燥得山藥茯苓復合酵素的干浸膏，計算干浸膏得率，測定總多糖百分含量[20]。

山藥、茯苓復合酵素的發酵工藝因素與水平設計見表5，發酵工藝正交設計試驗總多糖及干浸膏得率測定結果見表6，發酵工藝正交設計試驗總多糖含量及干浸膏得率因素間方差分析見表7，發酵工藝正交設計試驗總多糖各因素的水平間方差分析見表8。

表5 山藥、茯苓復合酵素的發酵工藝因素與水平設計

表6 發酵工藝正交設計試驗總多糖含量及干浸膏得率測定結果

干浸膏得率因素間方差分析皆無統計學意義，故不必進行水平間方差分析。

表7 發酵工藝正交設計試驗總多糖及干浸膏得率因素間方差分析

表8 發酵工藝正交設計試驗總多糖含量各因素的水平間方差分析

以總多糖百分含量為評價指標：A'、B'、C'因素水平間皆有統計意義，A'因素取2水平或3水平，即接種量10%或15%，考慮經濟效益，取2水平為佳，即接種量10%；B'因素取2水平或1水平，即發酵溫度31℃或34℃，考慮經濟效益，取1水平為佳，即發酵溫度31℃；C'因素取3水平，即發酵時間為72 h。以干浸膏得率為評價指標：A'、B'、C'、D'因素可任意取值，即同總多糖百分含量分析結果。

所謂的信息化人力資源管理主要指的是，組織中利用網絡化的技術手段，在意識與戰略性人力資源的支持下，展現較強的實踐性實施。

（2）山藥、茯苓復合酵素的發酵工藝驗證試驗結果。對山藥、茯苓復合酵素的發酵工藝所得到的優化工藝參數進行驗證：取3批山藥、茯苓等5味藥食同源中藥的水提干浸膏（即2.2.3項下的干浸膏），加30倍純化水研磨分散成混懸水溶液，加入混懸水溶液體積10%的菌液，在溫度31℃，轉速為180 r/min的條件下發酵72 h，將發酵液除菌后再冷凍干燥成干浸膏，測得總多糖百分含量為23.97%，RSD=1.843%（n=3），干浸膏得率為22.41%，RSD=1.972%，發酵工藝驗證結果略高于正交設計試驗中的最高值，表明該工藝科學、合理、穩定、可行。

2.4 山藥、茯苓復合酵素發酵前后總多糖百分含量對比分析

將山藥、茯苓復合酵素水提最優工藝與發酵最優工藝進行總多糖含量對比分析。

山藥、茯苓復合酵素發酵前后總多糖百分含量對比分析見表9。

由表9可知，山藥、茯苓等5味藥食同源中藥，經發酵后總多糖百分含量遠遠高于未經發酵的水提物中的總多糖百分含量，是發酵前水提物中總多糖百分含量的2.725倍。

表9 山藥、茯苓復合酵素發酵前后總多糖百分含量對比分析

3 結論

（1）以總多糖百分含量和干浸膏得率為評價指標，優化后的山藥茯苓復合酵素發酵工藝為發酵菌種植物乳酸桿菌，接種量10%，發酵溫度31℃，發酵時間72 h。山藥、茯苓水提液的最佳提取工藝為水提溫度95℃，加水量第1次為12倍，第2次為10倍，取時間第1次為2.0 h，第2次為1.5 h，超聲浸泡時間為0.5 h。在此工藝優化條件下，山藥茯苓復合酵素的總多糖百分含量達23.97%是發酵前水提山藥、茯苓等5味藥食同源中藥最優工藝總多糖百分含量（8.796%）的2.725倍。研究發現，通過植物乳酸桿菌發酵制作的山藥茯苓復合酵素中降血脂活性成分總多糖百分含量比發酵前含量顯著增加，很可能增強了產品的降血脂功能，為后期降血脂功能試驗提供理論依據，且同類研究未見報道。

（2）在預試驗中，采用同一份樣品比較發酵前后總多糖百分含量測定結果就得知發酵后比發酵前總多糖含量高很多，但發酵前后的工藝皆未優化，不能準確闡述發酵前后總多糖百分含量的對比變化結果，故在正式試驗時采用發酵前水提最優工藝3批驗證結果與發酵的最優工藝3批驗證結果進行比較，即得到了最科學合理正確的總多糖百分含量對比結果。

（3）試驗中僅采用了植物乳酸桿菌作為發酵菌種，未進行多種菌種的比較是因為植物乳酸桿菌對植物性發酵原料具有較強的生物活性轉化能力、且安全無毒，發酵工藝成熟，便于掌握，故最初選用該菌種進行預試，并且產生了預期的理想結果，故產品僅用植物乳酸桿菌作為發酵菌種。