酒用酯化酶利用酒尾生產酯化液研究

張 坤，馬美榮，王小偉

（北京紅星股份有限公司，北京 101400）

酯化酶不是酶學上的術語，酶學上名為解脂酶，是脂肪酶、酯合成酶、酯分解酶及磷酸酯酶的統稱。酯化酶的種類很多，但白酒生產中已應用的多為乙酸乙酯合成酶及己酸乙酯合成酶。合成乙酸乙酯的生香酵母分泌的酶為乙酸乙酯合成酶[1-3]。紅曲霉、根霉、毛霉等產生的酯化酶多為己酸乙酯合成酶[4-7]。許多細菌也能產生酯化酶[8-11]。清香型白酒是以乙酸乙酯為主體香的白酒，采用酶工程技術生產富含乙酸乙酯的酯化液具有重要的研究價值。

酒用酯化酶是華南理工大學林影教授團隊開發的一種酶制劑，該酶用于非水相中催化合成短鏈芳香酯，結果表明，該酶可催化C10以下的酸和醇直接酯化合成多種短鏈芳香酯[12]，酸的轉化率達到90 %以上，該團隊也證實其在合成己二酸二異辛酯、香葉基丁酸、肉桂醇酯、萜烯醇芳香酯等酯類物質方面具有極強的催化能力[13-15]。該酶在黃水利用、丟糟發酵中得到了良好應用[16-17]。

酒尾是白酒蒸餾后期截取的酒精度較高的酒-水混合物。酒尾中含有大量酸味物質及高級脂肪酸酯類，因此酒尾用來調整酒的酸度及后味效果明顯。但用量不可過大，超過20 %將影響低度酒的透明度，而且會給酒帶來酒稍子味[18-19]。

酒尾中富含大量乙醇、酸味物質，如能通過酯化酶生產酯化液，對提高酒尾的附加值具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

耗材及試劑：酒用酯化酶，華南理工大學提供；酒尾，北京紅星股份有限公司釀造車間提供；乙酸（AR），購自天津市風橋化學試劑科技有限公司。

儀器設備：氣相色譜儀（HP6890），安捷倫公司；生化培養箱（LRH-250），上海一恒科學儀器有限公司；全自動密度儀（DMA5000M），安東帕公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酒精度測定

采用密度法進行測定。

1.2.2 微量成分測定（氣相色譜儀法）

色譜條件：DM-WX毛細管柱，柱溫程序升溫，檢測器溫度240 ℃，汽化室溫度230 ℃。載氣流速：氮氣35 mL/min，氫氣40 mL/min，空氣400 mL/min。

1.2.3 酯化酶催化酒尾合成乙酸乙酯

200 mL酒尾中加入5 %的酯化酶，30 ℃酯化1 d、2 d、3 d，酯化液用氣相色譜分析。

1.2.4 酯化酶催化酒尾、乙酸合成乙酸乙酯

192 mL酒尾中加入8 mL乙酸再加入5%的酯化酶，30 ℃酯化1 d、2 d、3 d，酯化液用氣相色譜分析。

1.2.5 不同乙酸用量對酯化酶催化酒尾、乙酸合成乙酸乙酯的影響

分別按照1%、2%、3%、4%的乙酸比例配制酒尾、乙酸混合液，再加入5%的酯化酶，30 ℃酯化2 d、3 d，酯化液用氣相色譜分析。

1.2.6 溫度對酯化酶催化酒尾、乙酸合成乙酸乙酯的影響

194 mL酒尾中加入6 mL乙酸，加入5 %的酯化酶，分別在25 ℃、30 ℃、35 ℃酯化2 d，酯化液用氣相色譜分析。

1.2.7 不同酯化酶用量對酯化酶催化酒尾、乙酸合成乙酸乙酯的影響

194 mL酒尾中加入6 mL乙酸，再分別加入1 %、2 %、3 %、4 %、5 %的酯化酶，30 ℃酯化2 d，酯化液用氣相色譜分析。

1.2.8 酯化酶酶活穩定性

194 mL酒尾中加入6 mL乙酸，再加入3 %的酯化酶，30 ℃酯化2 d，酯化液分離后的酶繼續加入同樣比例的酒尾、乙酸，30 ℃酯化2 d。直至酯化液中乙酸乙酯含量大幅下降，停止實驗。

2 結果與討論

2.1 酒尾成分分析(表1)

表1 酒尾成分分析

該酒尾的酒精度為26%vol，酒尾中除含有水、乙醇外，還含有種類眾多的微量成分。在所檢測條件下，在該酒尾中共檢測到36種微量成分，其中醛類4種，酮類3種，酯類7種、醇類13種、酸類7種，烷類2種，乳酸乙酯的含量最高，為4663.75 mg/L，其次為乙酸、乙酸乙酯，含量分別為3669.09 mg/L、1118.51 mg/L，這3種物質的含量占總微量成分的84.83%。酒尾中含有較豐富的乙酸、乙醇，為酯化酶催化乙酸乙酯合成提供了一定的物質基礎。

2.2 酯化酶利用酒尾合成乙酸乙酯

根據酶用量推薦量、酶作用的推薦溫度，在酒尾中加入5 %酯化酶在30 ℃下酯化的結果見圖1。由圖1可見，在酒尾中加入酯化酶后，乙酸含量下降明顯，乳酸乙酯下降幅度也大，但乙酸乙酯增加量不大，最高增加約0.36 g/L，與預期差別較大，可能是因為酒尾中成分比較復雜，酯化酶催化乙酸、乙醇合成乙酸乙酯的活性受到其他成分的影響。

圖1 酯化酶利用酒尾合成乙酸乙酯

2.3 酯化酶利用酒尾、乙酸合成乙酸乙酯

酒尾直接加入酯化酶酯化效果一般，酒尾中乙醇含量應該是過量的，可能是由于乙酸含量不足導致酯化效果不佳。因此在酒尾中加入乙酸，探討加入乙酸是否有利于酯化合成。加入乙酸后，由于反應體系中乙酸濃度過高，所采用的色譜條件不能準確反映酯化液中的乙酸含量，且本研究主要關注酯類物質變化，故此后實驗不再對酯化液中的乙酸含量進行分析比較。從圖2可看出，酒尾中加入乙酸再用酯化酶酯化乙酸、乙醇，酯化液中乙酸乙酯含量大幅增加。隨著酯化時間增加，乙酸乙酯含量在第2天達到最高，第3天又下降，乳酸乙酯隨著酯化時間增加，前兩天下降幅度大。經比較酯化液中乙酸乙酯、乳酸乙酯含量，在本酯化條件下，酯化2 d比較合適。在本研究條件下，該酯化體系具有增加乙酸乙酯降低乳酸乙酯效果。

圖2 酯化酶利用酒尾、乙酸合成乙酸乙酯

2.4 不同乙酸用量對酯化酶酯化酒尾的影響（表2）

表2 不同乙酸用量對酯化酶酯化酒尾的影響

采用不同的乙酸用量，比較2 d和3 d的酯化結果，都是隨著反應時間增加，乙酸乙酯含量反而下降，乳酸乙酯含量也下降。從結果來看，采用本研究體系，酯化時間以2 d為宜。從反應2 d的結果來看，酯化反應體系中乙酸用量每增加約10 g/L，乙酸乙酯含量約增加3 g/L。結合實際生產需求，后續實驗采用3%的乙酸用量。

2.5 溫度對酯化酶酯化酒尾、乙酸的影響

溫度既影響酶的催化反應速度，又影響酶的活性。參考資料[17]，采用25 ℃、30 ℃、35 ℃考察溫度對酯化反應的影響。從圖3可以看出，從25 ℃到30 ℃，隨著反應溫度升高，乙酸乙酯、乳酸乙酯的含量增加，但從30 ℃到35 ℃，隨著反應溫度升高，乙酸乙酯、乳酸乙酯的含量降低，這說明高溫并不利于酯化反應。根據實驗結果，酯化溫度確定為30 ℃。

圖3 溫度對酯化酶酯化酒尾、乙酸的影響

2.6 不同酯化酶用量對酯化酶酯化酒尾、乙酸的影響

在酒尾中加入3%乙酸后，通過添加不同量的酯化酶，考察酶用量對酯化的影響見圖4。由圖4可以看出，酶作為反應的主要限制性因素，酶添加量對乙酸乙酯的生成有很大的影響。隨著酶添加量的增加，乙酸乙酯的含量先增加再趨于平穩，當酶用量超過3 %（W/V）時，乙酸乙酯的含量不增加，還略微下降，從數據來看，乳酸乙酯的含量隨著酶用量的增加是逐步增加的，但增加幅度不大。考慮到清香型白酒的主體香為乙酸乙酯，結合酶的成本，后續實驗采用3%的酶用量。本研究的酶用量研究結果不同于脂肪酶酯化白酒黃水的酶用量研究結果，這可能是與兩者的化學組成差別大有關，且與黃水中含有各種微生物有關[20]。

圖4 酯化酶用量對酯化酶酯化酒尾、乙酸的影響

2.7 酯化酶酶活性穩定性

為了提高酯化酶的使用效率，降低生產成本，進行了該酶酶活穩定性實驗，結果見圖5。由圖5可見，前4批重復實驗的酯化液乙酸乙酯含量基本保持穩定。第5批重復實驗時，酯化液中乙酸乙酯含量大幅下降，比第1批實驗降低了18.92 %。各批重復實驗酯化液的乳酸乙酯含量差別不大。該酶在酒尾、乙酸酯化體系下，具有較好的酶活性穩定性。該酶能回收利用，將極大降低酶的使用量，降低生產成本。

3 結論

通過對酒尾微量成分分析，酒尾中含有較豐富的乙酸、乙醇，為采用酒用酯化酶催化乙酸乙酯合成提供了一定的物質基礎。通過乙酸用量、溫度、酶用量、酯化時間對反應影響研究，確定酯化酶酯化酒尾、乙酸的條件為：乙酸用量3%，溫度30 ℃，酯化酶用量3%，酯化2 d。該酯化工藝作用溫和，反應周期短，酯化液中乙酸乙酯含量高，具有一定的推廣應用價值。