哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路調控豬腸上皮細胞精氨酸轉運的機制

肖 昊 趙 一 王 麗 譚碧娥

(1.廣東省農業科學院動物科學研究所，農業部華南動物營養與飼料重點實驗室，畜禽育種國家重點實驗室，嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室茂名分中心，廣東省畜禽育種與營養研究重點實驗室，廣州 510640；2.中國科學院亞熱帶農業生態研究所，中國科學院亞熱帶農業生態過程重點實驗室，湖南省動物營養生理與代謝過程湖南省重點實驗室，長沙 410125)

腸道是仔豬生長發育的核心和快速生長的基礎，氨基酸作為腸道優先利用的重要營養物質，對腸道生長發育發揮起著重要的作用，其中精氨酸(Arg)在調節動物營養代謝和生長發育等多種生理功能中發揮著重要作用[1]。Arg能刺激蛋白質合成、細胞增殖、DNA合成、細胞保護作用和遷移等細胞合成代謝途徑[2-5]。本課題組前期研究表明應激因素通過下調哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路相關蛋白的水平及活性，破壞斷奶仔豬腸道形態和功能，飼糧中加入適量的Arg可通過激活mTOR信號通路緩解仔豬腸道損傷，改善腸上皮細胞增殖和胞內蛋白質合成[6]；Arg增加了脂多糖(LPS)處理下豬腸上皮細胞中涉及mTOR信號通路的蛋白質的合成[5]。溶酶體氨基酸轉運體溶質載體家族蛋白38成員A9(SLC38A9)和CASTOR1是mTOR復合物1(mTORC1)信號通路的Arg傳感器[7]。研究發現，通過雷帕霉素(Rap)抑制mTOR后Arg在細胞內的濃度較細胞外升高了42.2%[8]。然而，目前對于mTORC1失調所引發的信號通路及對Arg攝取與代謝了解甚少。

y+(高親和力、非Na+依賴轉運體)和Na+依賴轉運體(如b0,+、B0,+和y+L)系統是Arg轉運的2個主要的轉運系統。腸上皮細胞中70%的L-Arg都是通過y+系統運輸。本課題組前期研究表明，L-硝基精氨酸甲酯可通過抑制一氧化氮(NO)通路增加Arg攝取以及陽離子氨基酸轉運載體2(CAT2)和L型氨基酸轉運載體1(LAT1)的蛋白表達[9]。然而，Arg的降解和轉運對調節Arg通量的作用尚未明晰。本研究利用Rap抑制mTOR信號通路，基于mTOR信號通路探討其在豬腸上皮細胞Arg攝取中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

豬腸上皮細胞(IPEC-J2細胞)以及Arg缺失的DMEM-H培養基配制、細胞培養、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)、Western blotting等試驗所需試劑與耗材的來源均同前期相關研究[10]。

1.2 試驗設計及方法

1.2.1 細胞培養

用含不同濃度Arg(100、350 μmol/L)和Rap(0、10 nmol/L)的DMEM-H培養基培養IPEC-J2細胞，細胞培養方法參照前期相關研究[10]，培養3 d后，收集細胞用于細胞周期、RNA提取、蛋白檢測。

1.2.2 細胞增殖檢測

1.2.2.1 四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測吸光度(OD)值

將IPEC-J2細胞按照1×104個/孔接種于96孔培養板中，以含不同濃度Rap(0、5、10、25、50、100 nmol/L)的DMEM-H培養基培養3 d后，參照MTT試劑盒說明書檢測OD值。

1.2.2.2 細胞計數

將IPEC-J2細胞按照1×105個/孔接種于24孔培養板中，以含不同濃度Rap(0、5、10、25、50、100 nmol/L)的DMEM-H培養基培養3 d后，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，使用胰蛋白酶消化細胞，終止消化后1 000 r/min離心，去除上清液，重懸細胞后使用血細胞計數器計量細胞數量。

1.2.2.3 5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷(EdU)檢測

EdU檢測試劑盒購于瑞博生物技術有限公司，檢測步驟按照說明書進行，簡要的過程主要包括EdU標記、細胞固定化、Apollo染色、DNA染色及圖像攝取及分析。除了試劑盒中具備的，所用甘氨酸、多聚甲醛等試劑均為國產分析純。采用熒光顯微鏡觀察，在不同波長下獲取圖像，得到的紅色細胞為增殖細胞，藍色細胞為所有細胞，計算細胞增殖率。

細胞增殖率(%)=(增殖細胞數目/所有細胞數目)×100。

1.2.2.4 細胞周期檢測

采用凱基細胞周期檢測試劑盒(KGA521)檢測Arg或Rap處理后細胞周期變化，檢測步驟參照試劑盒說明書進行。使用胰蛋白酶收集細胞后，輕輕吹打，混勻，使細胞分散成單個細胞。細胞用75%乙醇4 ℃固定過夜后，試驗當天4 000 r/min離心2 min，去除上清液，每1×106個細胞加入0.5 mL碘化丙啶染液(500 μL染色緩沖液、25 μL 20×碘化丙啶染色液、10 μL 50×RNaseA)。重懸細胞，37 ℃避光溫浴30 min，4 ℃或冰浴避光保存，流式細胞儀分析細胞周期。

1.2.3 RT-qPCR檢測

RNA提取、測定，cDNA的獲得以及RT-qPCR的操作方法等參照前期相關研究[11]。以β-肌動蛋白(β-actin)作為內參，采用2-△△Ct法計算目的基因mRNA的相對表達量。本試驗中所有引物均由上海生工生物有限公司合成，引物序列見表1。

表1 Arg轉運載體的引物序列

1.2.4 Western blotting檢測

按照Tan等[5]的方法進行蛋白表達檢測。包括蛋白激酶Cα(PKCα)、陽離子氨基酸轉運載體1(CAT1)、CAT2和β-actin在內的所有一抗購置于Santa Cruz Biotechnology公司。精氨酸酶Ⅰ、精氨酸酶Ⅱ、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、細胞外信號調節激酶(Erk)、磷酸化Erk(p-Erk)、cFos和磷酸化cFos(p-cFos)購置于美國Cell Signaling Technology公司。所有的目的蛋白的表達量均與β-actin進行對比。

1.2.5 細胞Arg攝取檢測

處理細胞后，移去培養基，轉移緩沖液沖洗細胞3次(37 ℃)。隨后每孔加1 mL含[3H]Arg的轉移緩沖液(2 μCi/mL，5 μmol/L)，搖床輕輕搖動5 min。棄去培養液，預冷的轉移緩沖液快速洗滌細胞3次。吹干細胞，每孔加500 μL 1 mol/L氫氧化鈉(NaOH)，37 ℃溶解細胞，然后加入250 μL乙酸，混勻。測定蛋白質的含量用50 μL細胞溶液。另取500 μL細胞溶液于18 mL閃爍計數瓶中，加15 mL閃爍液。25 ℃靜置過夜后測定[3H]Arg的每分鐘衰變數(DPM)。Arg的攝取率結果以nmol/(min·mg prot)表示。

1.3 數據分析

試驗數據用Excel 2019初步整理后，用SPSS 19.0軟件對樣本進行單因素方差分析和Turkey檢驗，使用Graph Prime 7生成數據圖。數據均是以100 μmol/L Arg組(對照組)作為參照的相對表達量表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。結果用平均值±標準誤(mean±SE)表示。

2 結果與分析

2.1 Rap抑制豬腸上皮細胞增殖

如圖1-A可見，隨著培養基中Rap的濃度從0 nmol/L升至100 nmol/L，OD值也隨之逐漸下降，并從10 nmol/L開始出現極顯著降低(P<0.01)。細胞計數結果顯示，細胞數量隨著Rap濃度的增加而降低，其中在10 nmol/L時細胞數量減少1/2(圖1-B)。因此，選取10 nmol/L作為隨后試驗中抑制mTOR信號通路的Rap工作濃度。培養基中Arg濃度為100 μmol/L時，添加10 nmol/L Rap后mTOR(P<0.01)和磷酸化mTOR(p-mTOR)(P<0.01)的蛋白表達量及其下游的真核翻譯起始因子4E結合蛋白1(4EBP1)(P>0.05)和磷酸化4EBP1(p-4EBP1)(P<0.01)的蛋白表達量均有不同程度的降低，表明10 nmol/L Rap抑制了mTOR信號通路(圖2)。在添加10 nmol/L Rap條件下，將培養基中Arg濃度由100 μmol/L提高到350 μmol/L，極顯著提高了4EBP1、p-4EBP1和磷酸化p70核糖體S6激酶(p-P70S6K)的蛋白表達量(P<0.01)。EdU檢測結果(圖3)表明，培養基中Arg濃度為100 μmol/L時，添加Rap極顯著降低了細胞的增殖率(P<0.01)，而在Arg濃度為350 μmol/L的培養基中添加Rap對細胞的增殖率沒有產生顯著影響(P>0.05)。

數據柱標注“**”表示與0 nmol/L相比差異極顯著(P<0.01)。Value columns with “**” mean extremely significant difference compared with 0 nmol/L (P<0.01).

Arg：精氨酸 arginine；Rap：雷帕霉素 rapamycin；4EBP1：真核翻譯起始因子4E結合蛋白1 eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1；p-4EBP1：磷酸化真核翻譯起始因子4E結合蛋白1 phosphorylated eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1；p-P70S6K：磷酸化p70核糖體S6激酶 phosphorylated p70 ribosomal protein S6 kinase；mTOR：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 mammalian target of rapamycin；p-mTOR：磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 phosphorylated mammalian target of rapamycin；β-actin：β-肌動蛋白。

A：熒光顯微鏡觀察圖 fluorescence microscope observation map；B：增殖率 proliferation rate。Arg：精氨酸 arginine；Rap：雷帕霉素 rapamycin；DAPI：4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 4′,6-diamidino-2-phenylindole；EdU：5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷 5-ethynyl-2′-deoxyuridine；Merge：融合。

2.2 Rap抑制細胞周期運轉

細胞周期分析結果顯示，當培養基中Arg濃度為100或350 μmol/L時，添加Rap后細胞大部分停留在G1期，相對于100 μmol/L Arg組，100 μmol/L Arg+Rap組和350 μmol/L Arg+Rap組的G2期和S期細胞數量均極顯著降低(P<0.01)，凋亡細胞數量也隨之極顯著降低(P<0.01)(圖4)。結合2.1中結果，表明Rap抑制了mTOR信號通路的活性，從而抑制豬腸上皮細胞增殖，提高Arg濃度能顯著改善Rap對細胞增殖的抑制作用。

A：流式細胞直方圖 flow cell histogram；B：細胞周期數據統計結果 cell cycle data statistical results。 Arg：精氨酸 arginine；Rap：雷帕霉素 rapamycin；Channels：通道；Apoptosis:細胞凋亡；Dip：二倍體 diploid；G1：G1期 G1-phase；G2：G2期 G2-phase；S：S期 S-phase。

2.3 Rap通過激活磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)-蛋白激酶(Akt)-B細胞淋巴瘤2(Bcl2)信號通路抑制細胞凋亡

圖4顯示，Rap抑制IPEC-J2細胞凋亡。通過Western blotting檢測結果發現，在Arg濃度為100或350 μmol/L的培養基中添加Rap均極顯著促進了B細胞淋巴瘤-xL(Bcl-xL)的蛋白表達量，極顯著降低了細胞色素C(Cyt-C)的蛋白表達量(P<0.01)。而僅在Arg濃度為100 μmol/L的培養基中添加Rap能夠極顯著降低半胱氨酸蛋白酶3(Caspase 3)和活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved Caspase 3)(17 ku)的蛋白表達量(P<0.01)；將培養基中Arg濃度由100 μmol/L提高到350 μmol/L后，添加Rap極顯著降低了Bcl2相關x蛋白(Bax)的蛋白表達量(P<0.01)，極顯著提高了Caspase 3和Cleaved Caspase 3(19 ku)的蛋白表達量(P<0.01)(圖5)。

Arg：精氨酸 arginine；Rap：雷帕霉素 rapamycin；Cyt-C：細胞色素C cytochrome C；Bax：Bcl2相關x蛋白 Bcl2 associated X protein；Bcl-xL：B細胞淋巴瘤-xL B-cell lymphoma-extra large；Caspase 3：半胱氨酸蛋白酶3 cysteine aspartic acid specific protease 3；Cleaved Caspase 3：活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 cleaved cysteine aspartic acid specific protease 3。

圖6顯示，培養基中Arg濃度為100 μmol/L時，添加Rap后p-PI3K和p-Akt的蛋白表達量均極顯著降低(P<0.01)，而Akt的蛋白表達量極顯著升高(P<0.01)。將培養基中Arg濃度由100 μmol/L提高到350 μmol/L后，添加Rap極顯著提高了p-PI3K、Akt和p-Akt的蛋白表達量(P<0.01)。因此，Rap抑制豬腸上皮細胞凋亡可能是通過激活PI3K-Akt-Bcl2信號通路實現的。

Arg：精氨酸 arginine；Rap：雷帕霉素 rapamycin；Akt：蛋白激酶 protein kinase；p-Akt：磷酸化蛋白激酶 phosphorylated protein kinase；PI3K：磷脂酰肌醇-3-羥激酶 phosphatidylinositol-3-hydroxykinase；p-PI3K：磷酸化磷脂酰肌醇-3-羥激酶 phosphorylated phosphatidylinositol-3-hydroxykinase；β-actin：β-肌動蛋白。

2.4 PKCα-Erk/cFos-CAT2信號通路可能是Rap調控Arg轉運載體促進Arg攝取的關鍵通路

為進一步探討mTOR信號通路在細胞Arg攝取過程中的作用，利用同位素示蹤法檢測了Rap處理下不同培養基處理的細胞中Arg的攝取率。圖7顯示，提高培養基中Arg濃度，IPEC-J2細胞的Arg攝取率極顯著上升(P<0.01)。而在不同濃度Arg培養基中添加Rap后，IPEC-J2細胞的Arg攝取率均極顯著上升(P<0.01)，表明Arg濃度對其沒有影響。為進一步探討Rap通過何種機制促進Arg的轉運，本試驗檢測了Arg轉運載體的mRNA和蛋白表達量。圖8顯示，在Arg濃度為100或350 μmol/L的培養基中添加Rap極顯著提高了CAT2的mRNA表達量(P<0.01)，且極顯著降低了LAT1的mRNA表達量(P<0.01)，而在Arg濃度為350 μmol/L的培養基中添加Rap則極顯著降低了CAT1的mRNA表達量(P<0.05)。將培養基中Arg濃度由100 μmol/L提高到350 μmol/L，CAT1、CAT2和LAT1的mRNA表達量沒有顯著變化(P>0.05)。圖9顯示，在Arg濃度為100或350 μmol/L的培養基中添加Rap均極顯著降低了CAT1和質子偶聯氨基酸轉運蛋白1(PAT1)的蛋白表達量(P<0.01)，極顯著增加了鈉離子依賴的中性氨基酸轉運蛋白2(SNAT2)的蛋白表達量(P<0.01)。而在100 μmol/L Arg培養基中添加Rap和350 μmol/L Arg培養下則極顯著提高了CAT2的蛋白表達量(P<0.01)。

Arg：精氨酸 arginine；Rap：雷帕霉素 rapamycin。

Arg：精氨酸 arginine；Rap：雷帕霉素 rapamycin；CAT1：陽離子氨基酸轉運載體1 cationic amino acid transporter 1；CAT2：陽離子氨基酸轉運載體2 cationic amino acid transporter 2； LAT1：L型氨基酸轉運載體1 L-type amino acid transporter 1 。

Arg：精氨酸 arginine；Rap：雷帕霉素 rapamycin；CAT1：陽離子氨基酸轉運載體1 cationic amino acid transporter 1；CAT2：陽離子氨基酸轉運載體2 cationic amino acid transporter 2；PAT1：質子偶聯的氨基酸轉運蛋白1 proton-coupled amino acid transporter 1；SNAT2： 鈉離子依賴的中性氨基酸轉運蛋白 2 sodium-coupled neutral amino acid transporter 2；β-actin：β-肌動蛋白。

上述結果表明，CAT2無論是在蛋白水平還是在mRNA水平的表達量，在100 μmol/L Arg +Rap處理下都是上調的，因此猜測CAT2是Rap調控Arg攝取率上升的關鍵轉運載體。72 h培養后結果(圖10)表明，100 μmol/L+Rap處理極顯著提高了PKCα、p-Erk、p-cFos、cFos和CAT2的蛋白表達量(P<0.01)，極顯著降低了Rictor的蛋白表達量(P<0.01)；而350 μmol/L Arg+Rap處理則極顯著降低了PKCα和Rictor的蛋白表達量(P<0.01)，極顯著提高了p-Erk的蛋白表達量(P<0.01)。結果提示，Rap抑制mTOR信號通路后可能通過PKCα-Erk/cFos-CAT2信號通路調控Arg轉運載體促進Arg的攝取。

Arg：精氨酸 arginine；Rap：雷帕霉素 rapamycin；PKCα：蛋白激酶Cα protein kinase Cα；Erk：細胞外信號調節激酶 extracellular signal-regulated kinase；p-Erk：磷酸化細胞外信號調節激酶 phosphorylated extracellular signal-regulated kinase；CAT2：陽離子氨基酸轉運載體2 cationic amino acid transporter 2。

3 討 論

氨基酸在動物腸道應激損傷的修復中起著關鍵作用。本課題組在研究嘔吐毒素對腸道黏膜的應激損傷中發現，嘔吐毒素能顯著降低空腸和回腸黏膜中的p-Akt和p-mTOR的蛋白表達量，同時降低空腸黏膜中p-4EBP1的蛋白表達量[6]。飼糧中添加氨基酸如谷氨酸能顯著降低嘔吐毒素對Akt/mTOR/4EBP1信號通路的抑制作用[11]。mTOR是細胞生長和增殖的一個關鍵的調節因子，通過磷酸化作用調控mRNA的翻譯來調節很多生理過程，包括蛋白質合成、核糖體生物合成及自噬作用等[12-13]。本課題組前期研究表明，Arg濃度影響豬腸上皮細胞營養核心通路mTOR信號通路及蛋白質合成的信號通路，適宜提高Arg濃度通過激活mTOR信號通路降低蛋白質降解，有助于提高細胞增殖[14]。本研究發現，mTOR抑制劑Rap能極顯著降低豬上皮細胞增殖，提高Arg濃度可通過提高細胞增殖率緩解mTOR抑制對細胞的損傷。本課題組前期研究還表明，mTOR信號通路的激活是Arg緩解細胞應激損傷的重要機制[4]，其中Arg分解代謝產物如多胺和NO可能參與對DNA的修復作用[15]，促進細胞周期的正常進程[16]。此外，Arg也能有效緩解LPS對豬腸上皮細胞周期的抑制作用[5]。本試驗結果顯示，添加Rap抑制mTOR信號通路，進而抑制細胞周期，然而提高Arg濃度并不能改善Rap對細胞周期的抑制作用。由于提高Arg濃度能促進細胞周期中S期細胞數量且激活mTOR信號通路[5]，猜測Arg可能主要通過mTOR信號通路來實現對細胞周期的調控，因此mTOR信號通路被抑制后即使提高培養基中的Arg濃度也不能有效緩解Rap對細胞周期的抑制作用。mTORC1激活后能調節下游效應，主要的下游信號為核糖體S6激酶(S6K)和4EBP，S6K和4EBP主要用來調節RNA的轉錄和蛋白質的翻譯合成[12]。本研究發現添加Rap后PI3K-Akt信號通路被抑制，而提高Arg濃度可有效緩解Rap帶來的抑制作用。

細胞凋亡受到Bcl2家族、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族以及癌基因如p53等多基因調控。本研究發現添加Rap極顯著降低了細胞凋亡率，抑制豬腸上皮細胞的凋亡。Hosoi等[17]的研究表明，在人橫紋肌肉瘤細胞中Rap誘導非p53依賴的細胞凋亡。本研究顯示，長期的Rap處理抑制細胞增殖，減少了細胞自發性的凋亡；提高Arg濃度緩解了Rap對豬腸上皮細胞增殖的抑制作用；提高Arg濃度對細胞周期沒有顯著影響，猜測提高Arg濃度可能通過影響細胞的凋亡來緩解Rap的抑制作用；同時，提高Arg濃度加強了對細胞凋亡的抑制。Cyt-C對啟動細胞凋亡起著重要作用，從線粒體釋放是細胞凋亡的關鍵步驟。本試驗檢測了Cyt-C的蛋白表達量，添加Rap降低了Cyt-C的蛋白表達量。Bcl2家族和Caspase家族蛋白也是調控凋亡的重要蛋白。Bcl2家族蛋白可以分為兩大類：第1類為抗凋亡蛋白，主要有Bcl2、Bcl-xL、B細胞淋巴瘤-W(Bcl-W)等；第2類為促凋亡蛋白，主要包括Bax、Bcl2拮抗/殺傷因子(Bak)、B細胞淋巴瘤-XS(Bcl-XS)、Bcl-xL/Bcl2相關死亡促進因子(Bad)、BH3結構域凋亡激動劑(Bid)等[18-20]。Rap提高抗凋亡蛋白Bcl-xL的蛋白表達量，同時抑制促凋亡蛋白Bax和Caspase 3的蛋白表達量，從而抑制豬腸上皮細胞凋亡，提高Arg濃度加劇抑制凋亡，緩解細胞損傷。

本研究中，外源性添加高濃度Arg顯著提高Arg的攝取率。Arg的轉運主要是通過細胞膜上的特殊陽性轉運載體——y+(包括CAT1、CAT2、CAT3、CAT4載體蛋白)、B0+(ATB0+)、b0+(b0+AT)以及y+L(包括y+LAT1、y+LAT2載體蛋白)系統實現的[20]。Rap促進了Arg轉運載體CAT2的蛋白及mRNA表達，降低了LAT1的mRNA以及CAT1和LAT1的蛋白及mRNA表達，暗示著提高Arg轉運主要歸功于CAT2和LAT1的表達。CAT2主要負責轉入Arg，而LAT1負責轉出Arg。因此增加的CAT2和降低的LAT1促使了Arg的攝取。Visigalli等[8]發現，在人內皮細胞中Rap能通過CAT2來刺激Arg的轉運。在大鼠的骨骼肌中，CAT2A在應激狀況下被激活，如外科手術創傷或是食物缺乏。這就意味著CAT2A可能作為從蛋白質分解出的Arg的輸出通道。考慮到mTOR復合物分為mTORC1和mTOR復合物2(mTORC2)，大部分時候只有mTORC1對Rap敏感，而mTORC2對其不敏感。長期的Rap處理可以降低mTORC2的活性。Rap可能通過影響mTORC1的表達，從而提高mTORC2的活性來促使CAT2的表達。上述結果表明，長期的Rap處理抑制細胞PI3K-Akt信號通路及mTORC2的活性，從而抑制細胞凋亡。本試驗結果顯示添加Rap后CAT2、PKCα和Erk的蛋白表達量隨之上升。由此可以說明，細胞在處于Rap應激的狀況下生長因子和營養物質通過mTOR信號通路促進蛋白質合成和細胞生長。因此，抑制mTOR信號通路將會使營養物質的轉運減少[21]。綜合以前的試驗結果，CAT1表達與營養刺激有關，隨著mTOR信號通路的活性變化，而只有CAT2的表達受到極端環境的刺激[21]。Rap處理下細胞內的Arg攝取增加主要取決于CAT2的蛋白表達量增加及mTOR信號通路被抑制而引起的蛋白質的水解[8]。由于提高Arg濃度后CAT2的蛋白表達量下降，但是細胞內的Arg轉運和Arg的濃度都比對照組要高，因此可能存在一個未知的通路影響著Arg的攝取。Visigalli等[8]發現，添加腫瘤壞死因子-α(TNF-α)也能通過提高CAT2的蛋白表達量來提高Arg的轉運，這主要是通過激活核轉錄因子-κB(NF-κB)信號通路來實現，同時也與TNF-α激活PI3K-Akt-mTOR信號通路有關；此外，同時添加Rap和TNF-α能更進一步提高Arg的轉運。由此推測，在Rap添加后細胞可能通過激活NF-κB信號通路來激活CAT2的表達。本試驗同時檢測到轉錄因子Erk和cFos的蛋白表達量上升。因此，推測Rap抑制mTOR信號通路，細胞內蛋白質分解增加，細胞激活PI3K-Akt信號通路來抑制凋亡，而Rap應激使得轉錄因子Erk、cFOS處于高表達水平，從而進入細胞核參與CAT2的轉錄使其表達量上升，從而使得細胞內的Arg濃度上升，這是細胞的一種對環境刺激而產生的反饋機制。激活PKCα-Erk/cFos-CAT2信號通路，使得Arg濃度上升，CAT2的蛋白表達量極顯著上升，促進Arg轉運，緩解細胞損傷。這些結論還需要設計更進一步的試驗進行驗證。

4 結 論

① Rap顯著抑制豬腸上皮細胞周期運轉，抑制mTOR信號通路，提高Arg濃度可有效緩解Rap對細胞增殖的抑制。

② Rap通過激活PI3K-Akt-Bcl2信號通路抑制細胞凋亡。

③ Rap可能通過PKCα-Erk/cFos-CAT2信號通路調控CAT2的表達，從而促進Arg的攝取，修復細胞損傷。