飼料中添加不同水平玉米干酒糟及其可溶物對(duì)斑點(diǎn)叉尾生長(zhǎng)、體色、肉色、血清生化指標(biāo)及腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

耿 彬 陳開健* 劉 祥 魏澤宏 易新文 胡 毅** 唐 濤

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)研究中心，長(zhǎng)沙 410128；2.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，省部共建淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410081；3.深圳市澳華集團(tuán)股份有限公司，深圳 518067)

豆粕因蛋白質(zhì)含量高且氨基酸組成較為均衡而成為水產(chǎn)飼料中重要的蛋白質(zhì)源，但隨著國(guó)內(nèi)水產(chǎn)行業(yè)的迅速發(fā)展，豆粕需求量逐年增長(zhǎng)，而我國(guó)大豆主要依靠進(jìn)口，加之近年來中美貿(mào)易關(guān)系緊張，導(dǎo)致大豆價(jià)格持續(xù)走高，因此尋找成本低廉且對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物無負(fù)面影響的替代蛋白質(zhì)源顯得尤為重要。玉米干酒糟及其可溶物(DDGS)是玉米產(chǎn)出燃料乙醇后，再通過低溫干燥處理形成的含有可溶固形物的干酒糟。玉米DDGS中蛋白質(zhì)、纖維素、維生素和脂肪含量較高，且價(jià)格低廉，來源廣泛[1-2]。玉米DDGS在畜禽生產(chǎn)中已有廣泛的研究和應(yīng)用，有研究表明飼糧中添加適量玉米DDGS對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)無不利影響，但在肉雞飼糧中添加水平過高可能會(huì)導(dǎo)致雞胸肉產(chǎn)量下降[3]。有研究顯示，玉米DDGS中含有玉米黃質(zhì)及葉黃素，動(dòng)物攝入后會(huì)對(duì)肌肉、皮膚或其副產(chǎn)物顏色產(chǎn)生影響[4-5]，例如，在蛋雞飼糧中添加玉米DDGS會(huì)對(duì)蛋黃的顏色產(chǎn)生顯著影響。

關(guān)于玉米DDGS對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物影響的研究多集中在生長(zhǎng)和免疫方面，飼料中適量添加玉米DDGS對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能無負(fù)面影響且能在一定程度上提高機(jī)體免疫力[6-7]，但對(duì)體色、肉色和腸道菌群結(jié)構(gòu)的研究未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

以魚粉、豆粕為主要蛋白質(zhì)源，并分別添加0(對(duì)照組)、3%(D1組)、6%(D2組)和12%(D3組)的玉米DDGS(主要成分為蛋白質(zhì)、脂肪、粗纖維及有效磷)，配制4種試驗(yàn)飼料，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。飼料制備前先將飼料原料粉碎，過60目篩，按配比從小到大逐級(jí)定量均勻混合，再將其投入V型攪拌機(jī)充分混合25 min；隨后將豆油與混好的飼料干粉充分混勻，再噴入適量的水混合均勻，將混合均勻的飼料用單螺桿擠壓式飼料膨化機(jī)(安德里茨EX1250，中國(guó)，調(diào)制溫度100 ℃，出模溫度120 ℃左右)制成粒徑為3.0 mm的膨化飼料，陰涼處風(fēng)干后儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與養(yǎng)殖管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)在湖南省婁底市車田江水庫試驗(yàn)基地中進(jìn)行，試驗(yàn)魚統(tǒng)一購(gòu)于種苗公司，并在網(wǎng)箱(9 m×9 m×2 m)中暫養(yǎng)1個(gè)月，暫養(yǎng)期間投喂對(duì)照組飼料，分組前饑餓24 h。挑選規(guī)格一致、體格健康、初始體重(50.0±0.2)g的斑點(diǎn)叉尾1 150尾，隨機(jī)分配至23個(gè)網(wǎng)箱(網(wǎng)箱材料為聚乙烯，規(guī)格為1.5 m×1.5 m×2.0 m，使用前用3%的食鹽水浸泡5～10 min)，每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)分配50尾。將23個(gè)網(wǎng)箱共分為4個(gè)組，即1個(gè)對(duì)照組和3個(gè)試驗(yàn)組(D1組、D2組、D3組)，對(duì)照組分配8個(gè)網(wǎng)箱(重復(fù))，每個(gè)試驗(yàn)組均分配5個(gè)網(wǎng)箱(重復(fù))。每日分別在06:00、12:00、18:00進(jìn)行投喂，投喂量以魚體重的3%～5%為準(zhǔn)，每周根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整投喂量。每天早中晚測(cè)量并記錄水溫。養(yǎng)殖期間每周測(cè)定水體溶氧濃度以及pH。養(yǎng)殖期間水體溫度為(26.0±1.2) ℃，pH為7.4～7.8，溶解氧濃度>5 mg/L，氨氮濃度<0.01 mg/L。

1.3 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 生長(zhǎng)性能

存活率(%)=100×試驗(yàn)?zāi)~尾數(shù)/試驗(yàn)初魚尾數(shù)；增重率(%)=100×(終末體重-初始體重)/初始體重；飼料系數(shù)=總投喂量/(終末體重+死魚重量-初始體重)；攝食率(%/d)=100×總投喂量/[(初始均重+終末均重)×飼養(yǎng)天數(shù)/2]；特定生長(zhǎng)率(%)=100×(ln終末體重-ln初始體重)/飼養(yǎng)天數(shù)；肝體比(HSI，%)=100×肝臟重/體重；臟體比(VSI，%)=100×內(nèi)臟重/體重；肥滿度(CF，g/cm3)=100×體重/體長(zhǎng)3；腹脂率(AFP，%)=100×腹脂重/體重。

1.3.2 體色和肉色

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，從每個(gè)網(wǎng)箱中隨機(jī)取6尾魚，參考梁高楊等[9]的方法，用色差儀(NR110)測(cè)定腹部與側(cè)線附近皮膚的亮度(L*)、紅度(a*)、黃度(b*)值以及背部肌肉的L*、a*、b*值。具體測(cè)樣點(diǎn)如圖1所示。

圖1 體色測(cè)樣點(diǎn)(圖片來自百度網(wǎng)站)

1.3.3 血清生化指標(biāo)

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，從每個(gè)網(wǎng)箱中隨機(jī)取5尾魚，使用經(jīng)0.2%的肝素鈉潤(rùn)洗后的注射器自尾靜脈取血，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱，2 h后使用離心機(jī)3 000 r/min離心10 min，吸取血清并保存于-80 ℃冰箱中待測(cè)。血清堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)活性以及低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽汁酸(total bile acid,TBA)含量采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定，免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)、補(bǔ)體3(complement 3，C3)和補(bǔ)體4(complement 4，C4)含量采用浙江伊利康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 腸道菌群結(jié)構(gòu)

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，從每個(gè)網(wǎng)箱中隨機(jī)取3尾魚，用于腸道菌群結(jié)構(gòu)檢測(cè)樣品采集。將解剖盤與器材用75%酒精消毒后，在酒精燈旁取出魚體腸道后放入無菌離心管，于-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)腸道菌群結(jié)構(gòu)分析。使用天根總DNA提取試劑盒進(jìn)行斑點(diǎn)叉尾腸道菌群DNA提取。選取對(duì)照組、D2組、D3組DNA送北京諾和致源生物科技有限公司進(jìn)行腸道菌群測(cè)序，后續(xù)利用諾和致源售后平臺(tái)工具(https://magic.novogene.com)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS 25.0軟件采用單因素方差分析(one-way ANOVA)程序進(jìn)行方差分析，并采用Duncan氏法進(jìn)行組間多重比較。顯著水平為P<0.05，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié) 果

2.1 飼料中添加不同水平玉米DDGS對(duì)斑點(diǎn)叉尾生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，飼料中添加不同水平玉米DDGS替代部分豆粕對(duì)斑點(diǎn)叉尾的增重率、特定生長(zhǎng)率、存活率、飼料系數(shù)、攝食率、肝體比及肥滿度無顯著影響(P>0.05)。D2組的臟體比最高，顯著高于D3組(P<0.05)，與其他組差異不顯著(P>0.05)。D1組的腹脂率最高，顯著高于D2組(P<0.05)，與其他組差異不顯著(P>0.05)。

表2 飼料中添加不同水平玉米DDGS對(duì)斑點(diǎn)叉尾生長(zhǎng)性能的影響

2.2 飼料中添加不同水平玉米DDGS對(duì)斑點(diǎn)叉尾皮膚及肌肉色度值的影響

由表3可知，飼料中添加不同水平玉米DDGS替代部分豆粕對(duì)斑點(diǎn)叉尾腹部皮膚L*值無顯著影響(P>0.05)，但顯著升高了a*和b*值(P<0.05)。飼料中添加6%和12%的玉米DDGS使側(cè)面皮膚L*值顯著下降(P<0.05)，a*和b*值顯著升高(P<0.05)。各組間背部肌肉L*值無顯著差異(P>0.05)，各試驗(yàn)組a*和b*值均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且D2組和D3組b*值還顯著高于D1組(P<0.05)。由圖2可以看出，隨著飼料中玉米DDGS添加水平的升高，斑點(diǎn)叉尾肉色有肉眼可見的變黃趨勢(shì)。

表3 飼料中添加不同水平玉米DDGS對(duì)斑點(diǎn)叉尾皮膚及肌肉色度值的影響

圖2 斑點(diǎn)叉尾肌肉

2.3 飼料中添加不同水平玉米DDGS對(duì)斑點(diǎn)叉尾血清生化指標(biāo)的影響

由表4可知，飼料中添加不同水平玉米DDGS替代部分豆粕對(duì)斑點(diǎn)叉尾血清IgM、C4及TBA含量無顯著影響(P>0.05)。與對(duì)照組相比，D1組血清AKP活性和TC含量顯著升高(P<0.05)，D2組顯著降低(P<0.05)，D3組則無顯著變化(P<0.05)；D2組和D3組血清LDL、TG和C3含量顯著降低(P<0.05)，D1組則無顯著變化(P>0.05)。

表4 飼料中添加不同水平DDGS對(duì)斑點(diǎn)叉尾血清生化指標(biāo)的影響

2.4 飼料中添加不同水平玉米DDGS對(duì)斑點(diǎn)叉尾腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

根據(jù)生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)和體色、肉色差異，對(duì)對(duì)照組、D2組和D3組腸道菌群進(jìn)行測(cè)序。由圖3可知，對(duì)照組操作分類單元(OTU)數(shù)目為406個(gè)，D2組OTU數(shù)目為424個(gè)，D3組OTU數(shù)目為305個(gè)，3組共有的OTU數(shù)目為164個(gè)，對(duì)照組與D2組共有OTU數(shù)目為150個(gè)，對(duì)照組與D3組共有OTU數(shù)目為31個(gè)，D2組與D3組共有OTU數(shù)目為43個(gè)，對(duì)照組特有OTU數(shù)目為61個(gè)，D2組、D3組特有OTU數(shù)目均為67個(gè)。

圖3 OTU韋恩圖

2.4.1 門水平結(jié)構(gòu)分析

表5 門水平排名前5的物種相對(duì)豐度

Fusobacteria：梭桿菌門；Firmicutes：厚壁菌門；Proteobacteria：變形菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Actinobacteria：放線菌門；Cyanobacteria：藍(lán)細(xì)菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Chloroflexi：綠彎菌門；unidentified_Bacteria：未鑒定細(xì)菌；Spirochaetes：螺旋體門；Others：其他。

2.4.2 屬水平結(jié)構(gòu)分析

表6 屬水平排名前3的物種相對(duì)豐度

Cetobacterium：鯨桿菌屬；Lactococcus：乳球菌屬；Plesiomonas：鄰單胞菌屬；Macellibacteroides：屠場(chǎng)桿狀菌屬；Pseudogracilibacillus：假纖細(xì)芽胞桿菌屬；Pseudomonas：假單胞菌屬；Citrobacter：檸檬酸桿菌屬；Jeotgalicoccus：咸海鮮球菌屬；unidentified_Clostridiales：梭菌目未鑒定屬；Romboutsia：羅姆布茨菌屬；Others：其他。

3 討 論

3.1 飼料中添加不同水平玉米DDGS對(duì)斑點(diǎn)叉尾生長(zhǎng)性能的影響

研究表明，細(xì)鱗鯧(Piaractusmesopotamicus)幼魚飼料中添加玉米DDGS可提高飼料效率，對(duì)增重率和形體指標(biāo)無顯著影響[10]。本研究結(jié)果表明，飼料中添加不同水平玉米DDGS替代部分豆粕對(duì)斑點(diǎn)叉尾的生長(zhǎng)性能無顯著影響，與在草魚(Ctenopharyngodonidellus)[11]、鯉魚(Cyprinuscarpio)[11]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[6]和金頭鯛(Sparusaurata)[7]幼魚上的研究結(jié)果相似。何曉慶等[12]用玉米DDGS替代奧尼羅非魚(Oreochromisniloticus×O.mossambicus)飼料中的豆粕后發(fā)現(xiàn)各組臟體比、肝體比均無顯著差異。在本試驗(yàn)中，飼料中添加不同水平玉米DDGS替代部分豆粕對(duì)斑點(diǎn)叉尾的肝體比無顯著影響，但臟體比在添加水平為6%時(shí)最高，與在奧尼羅非魚[12]上所得結(jié)果不一致，其原因可能是飼料中植物性蛋白質(zhì)源或脂肪源在一定水平時(shí)會(huì)導(dǎo)致脂肪在魚體內(nèi)沉積[13-14]，當(dāng)玉米DDGS添加水平達(dá)到6%時(shí)，可能影響了斑點(diǎn)叉尾對(duì)脂質(zhì)的吸收利用，促進(jìn)脂肪在臟器中沉積，導(dǎo)致臟體比升高。

3.2 飼料中添加不同水平玉米DDGS對(duì)斑點(diǎn)叉尾體色和肉色的影響

魚類的皮膚和肌肉顏色的變化取決于攝取的類胡蘿卜素，魚類和其他動(dòng)物一樣，自生不能合成類胡蘿卜素[15]。玉米DDGS中含有的玉米黃質(zhì)和葉黃素會(huì)影響斑點(diǎn)叉尾皮膚和肌肉的b*值，b*值越大說明顏色越黃。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼料中玉米DDGS添加水平的變化未對(duì)斑點(diǎn)叉尾腹部皮膚和背部肌肉L*值產(chǎn)生顯著影響，但添加6%和12%玉米DDGS時(shí)，各部位皮膚a*值顯著升高，皮膚及肌肉b*值與a*值呈相似的變化趨勢(shì)，其可能的原因是玉米DDGS含有較高比例的類胡蘿卜素，且玉米DDGS中葉黃素和玉米黃質(zhì)的含量是黃色玉米的3倍，而類胡蘿卜素中的葉黃素及玉米黃質(zhì)能夠?qū)е卖~類體色和肉色變黃[16]，這與Li等[17]的研究結(jié)果相似。

3.3 飼料中添加不同水平玉米DDGS對(duì)斑點(diǎn)叉尾血清生化指標(biāo)的影響

血清中LDL、TC、TG和TBA含量是評(píng)價(jià)動(dòng)物肝膽健康及脂質(zhì)吸收代謝的重要指標(biāo)，LDL作為膽固醇的載體，其含量與血清中TC含量呈正相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著飼料中玉米DDGS添加水平的升高，血清中LDL、TC、TG含量均不同程度下降，血清TBA含量各組間無顯著差異，與黃文慶等[18]的研究結(jié)果相似。在亞麻籽飼料中添加玉米DDGS會(huì)顯著降低肉雞血清TG和TC含量[19]，說明飼料中添加玉米DDGS能改善脂質(zhì)吸收代謝且不會(huì)對(duì)肝臟功能造成負(fù)面影響。Shelby等[20]使用玉米DDGS部分替代飼料中豆粕后對(duì)尼羅羅非魚(OreochromisniloticusL.)血清免疫指標(biāo)并無顯著影響，本研究中血清IgM和C4含量的結(jié)果與其一致。AKP作為生物體內(nèi)重要的磷酸酶，能夠反映機(jī)體肝臟功能是否有損傷[21]。在正常情況下血清中AKP的活性保持在相對(duì)較低且穩(wěn)定的狀態(tài)下，只有當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)其活性才會(huì)升高[22]。本研究中，飼料中玉米DDGS添加水平為6%時(shí)血清AKP活性顯著低于對(duì)照組，添加水平為12%時(shí)與對(duì)照組差異不顯著，因此推測(cè)斑點(diǎn)叉尾攝入含6%或12%玉米DDGS的飼料后未對(duì)肝臟功能造成損傷。

3.4 飼料中添加不同水平玉米DDGS對(duì)斑點(diǎn)叉尾腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

硬骨魚類與水生環(huán)境直接接觸，因此水環(huán)境中復(fù)雜而動(dòng)態(tài)的微生物群落可能對(duì)其健康產(chǎn)生影響[23]。腸道黏膜表面是腸道菌群與宿主相互作用的主要部位，正常微生物群落在腸道黏膜表面的定植對(duì)腸道的消化吸收和機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能具有積極作用，而微生物群落失衡對(duì)魚體則會(huì)產(chǎn)生不利影響[24]。與水環(huán)境相比，消化道是一個(gè)營(yíng)養(yǎng)更豐富的生態(tài)系統(tǒng)，因此更有利于大多數(shù)細(xì)菌的生長(zhǎng)，但并不是所有進(jìn)入魚類消化道的食物中的細(xì)菌都會(huì)寄生在腸道內(nèi)[25]。存在于消化道中的微生物以寄主的食物為食，寄主的食物被它們和寄主自身產(chǎn)生的酶消化，而寄主產(chǎn)生的食糜決定了消化道中微生物的豐度和質(zhì)量組成[26]，因此飼料的組成成分會(huì)對(duì)其腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，斑點(diǎn)叉尾飼料中玉米DDGS添加水平不同不會(huì)改變腸道中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，其門水平上的梭桿菌門和屬水平上的鯨桿菌屬為其腸道中絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群。有研究表明魚類初級(jí)腸道菌群的建立取決于卵黃囊階段攝入的細(xì)菌種類，在首次進(jìn)食后保持不變，并在進(jìn)食后數(shù)周至數(shù)月內(nèi)形成穩(wěn)定菌群[27]，這有可能是本研究中不同組斑點(diǎn)叉尾腸道中絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群保持不變的原因。通過分析OTU韋恩圖發(fā)現(xiàn)，飼喂添加不同水平玉米DDGS飼料的斑點(diǎn)叉尾共有OTU的數(shù)目為164個(gè)，說明不同分組共有一個(gè)穩(wěn)定的核心菌群，這與何嬌嬌等[28]在研究發(fā)酵豆粕對(duì)大黃魚(Larimichthyscrocea)幼魚腸道菌群結(jié)構(gòu)影響時(shí)得出的結(jié)果相似。

在本試驗(yàn)中，當(dāng)飼料中玉米DDGS添加水平達(dá)到6%時(shí)，斑點(diǎn)叉尾腸道內(nèi)門水平的梭桿菌門、擬桿菌門和屬水平的鯨桿菌屬的相對(duì)豐度較其他2組有所上升。Qi等[29]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度氨會(huì)增加鯽魚(Carassiusauratusauratus)免疫相關(guān)基因和抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)，同時(shí)腸道中鯨桿菌屬的數(shù)量也會(huì)增加，鯨桿菌屬可能屬于能夠提高魚類免疫力的潛在有益菌。在對(duì)牛蛙的腸道微生物研究中發(fā)現(xiàn)，鯨桿菌屬能更好地提高氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝率[30]，膳食氨基酸是魚類生長(zhǎng)和維持所必需的，特別是處在生長(zhǎng)期的幼魚，某些氨基酸及其代謝物是關(guān)鍵代謝途徑的重要調(diào)節(jié)劑，對(duì)魚類生長(zhǎng)、采食、養(yǎng)分利用、免疫力、行為、幼蟲變態(tài)、繁殖以及對(duì)環(huán)境壓力和病原生物的抗性具有重要意義[31-32]。本研究結(jié)果還顯示，在飼料中添加玉米DDGS會(huì)提高斑點(diǎn)叉尾腸道中鯨桿菌屬的相對(duì)豐度，進(jìn)而改善其腸道菌群結(jié)構(gòu)。此外，玉米DDGS中富含動(dòng)物蛋白質(zhì)源中缺少的纖維素，相關(guān)研究表明擬桿菌門能有效利用纖維素生成短鏈脂肪酸，為機(jī)體供能，從而提高對(duì)飼料中養(yǎng)分的吸收利用[33]。因此，斑點(diǎn)叉尾腸道中鯨桿菌屬相對(duì)豐度的增加有可能維持了其飼料系數(shù)、增重率和特定生長(zhǎng)率不受玉米DDGS添加水平的影響。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)乳球菌屬是一種會(huì)導(dǎo)致淡水魚及海水魚干擾超急性和出血性敗血病的病原菌[34-35]，在本研究中，當(dāng)使用添加了6%玉米DDGS的飼料飼喂斑點(diǎn)叉尾時(shí)，其腸道中的乳球菌屬的相對(duì)豐度顯著低于其他2組，說明向飼料中添加DDGS或許能通過增加有益菌的數(shù)量來控制并減少有害菌的數(shù)量。

4 結(jié) 論

綜上所述，飼料中添加12%的玉米DDGS替代部分豆粕不會(huì)對(duì)斑點(diǎn)叉尾的存活、生長(zhǎng)、飼料利用、免疫力、腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不利影響，但會(huì)使其體色和肉色變黃。