飼糧氯化膽堿含量對湖羊瘤胃菌群和血漿氧化三甲胺含量的影響

周 陽 梅士俊 毛勝勇,2 金 巍,2*

(1.國家動物消化道營養國際聯合研究中心，江蘇省消化道營養與動物健康重點實驗室，南京農業大學消化道微生物研究室，南京 210095；2.南京農業大學動物科學類國家級實驗教學中心，南京 210095)

反芻動物的飼糧含有豐富的膽堿，研究已經證實膽堿在瘤胃中能夠被微生物快速降解，生成三甲胺，能夠到達小腸的飼糧源膽堿很少[5-6]。目前，關于飼糧膽堿含量對瘤胃微生物和血漿TMAO含量的影響還鮮有報道。因此，本試驗擬通過在湖羊飼糧中添加氯化膽堿，結合高通量測序方法和靶向代謝組學技術，研究飼糧氯化膽堿含量變化對瘤胃菌群和血漿TMAO含量的影響，為反芻動物的健康養殖提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用氯化膽堿未包被，含量99%，購自蘇州某生物科技有限公司。

1.2 試驗動物與飼養管理

本試驗于2018年12月19日至2019年1月24日在江蘇徐州蘇羊羊業有限公司進行。試驗選用12只育肥期健康公湖羊，體重(30.2±2.0) kg，隨機分為2組，每組6只羊，單欄飼養。對照組飼喂基礎飼糧；參考前期的研究結果和氯化膽堿在生產中的添加劑量，試驗組飼糧在基礎飼糧中添加0.05%的氯化膽堿。2組飼糧均制成全混合顆粒料，基礎飼糧組成及營養水平見表1，參照《肉羊飼養標準》(NY/T 815—2004)中育肥肉羊營養需要量配制。試驗預試期5 d，正試期28 d。試驗期間，每天飼喂2次(08:00和16:00)，自由采食和飲水。每天記錄采食量，每周晨飼前稱重1次。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.3 樣品采集

正式期第27天于早晨飼喂前用裝有肝素鈉的真空采血管通過頸靜脈取血，1 125×g離心15 min，取上清備測血漿TMAO含量。正試期第28天于早晨飼喂前屠宰采集瘤胃內容物用于細菌測序；采集瘤胃液經4層紗布過濾，濾液一部分用于測定pH，另一部分用于揮發性脂肪酸和氨氮含量的測定。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 瘤胃液揮發性脂肪酸和氨氮含量的測定

瘤胃液中揮發性脂肪酸含量參照Jin等[7]方法，利用安捷倫7890B(Agilent, California, USA)氣相色譜儀測定，色譜柱采用Fused silica capillary column (Supelco, Bellefonte, USA)。測定氨氮含量時，先將瘤胃液樣品4 000 r/min離心10 min(Scientific Sorvall Legend Micro 21R微量離心機，德國Thermo Fisher公司)取上清，參照Weatherburn[8]描述的方法，使用氯化銨作為標準品，利用比色法測定。

1.4.2 血漿TMAO含量的測定

體重管理除了控制飲食外還需適量的運動，運動和飲食就像一對雙胞胎，一個都不能少，孕婦需要適量的運動和合理的飲食才能控制整個孕期的增重量，把寶寶的體重控制在3千克左右，為自然分娩、母乳喂養和寶寶一輩子的健康打下良好的基礎。

血漿中TMAO的含量參照Xin等[9]的方法，利用LC-MS測定。100 μL血漿與200 μL乙腈混合沉淀蛋白，14 000×g離心10 min，2 μL上清液注入U3000 DGLC系統(Thermo Fisher Scientific, Waltham,美國)和Q Exactive質譜儀(Thermo Fisher Scientific, Waltham,美國)，TMAO在Waters BEH Amide column色譜柱上分離。檢測數據利用Xcalibur和TraceFinder 4.1(Thermo Fisher Scientific, Waltham,美國)收集和分析。

1.4.3 瘤胃微生物DNA提取

瘤胃微生物的DNA提取參照Jin等[7]方法。采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)結合酚-氯仿-異戊醇法提取。使用NanoDrop ND-2000(Thermo Fisher Scientific，美國)測定DNA濃度和純度，保證提取的樣品DNA的OD260/OD280在1.80～2.00，保存DNA樣品于-80 ℃冰箱備用。

1.4.4 實時熒光定量PCR

1.4.5 細菌16S rRNA基因的高通量測序及數據分析

對細菌16S rRNA基因的V3～V4區進行PCR擴增，引物序列為341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)[12]。擴增產物利用Illumina MiSeq PE250平臺進行測序(凌恩生物科技有限公司)。測序原始數據已經上傳到NCBI的SRA數據庫，登錄號為SRP271556。

高通量數據分析參照Xie等[13]方法，利用QIIME軟件(1.9.0版)進行。利用UPARSE在0.03水平上聚類操作分類單元(OTUs)[14]，α和β多樣性分析在序列深度29070上進行。基于Unweighted UniFrac metric進行主成分分析(PCoA)[15]。基于SILVA數據庫(Release132 http://www.arb-silva.de)對OTUs的代表性序列進行系統分類[16]。利用相似性分析(ANOSIM)評估組間菌群差異。利用線性判別(LDA)分析和LDA效應大小分析(LEfSe)找出導致組間菌群變化的生物標志物[17]。

1.5 數據處理

利用SPSS 22.0軟件進行數據分析。平均日采食量、平均日增重、料重比、瘤胃發酵參數、血漿TMAO含量以及實時熒光定量PCR數據利用獨立樣本t檢驗進行分析。微生物數據采用Kruskal-Wallis H(K)非參數檢驗分析。P<0.05表示差異顯著，0.05

2 結 果

2.1 添加氯化膽堿對湖羊生長性能的影響

如表2所示，添加0.05%的氯化膽堿對湖羊平均日采食量(P=0.879)、平均日增重(P=0.234)和料重比(P=0.164)沒有顯著影響。

表2 添加氯化膽堿對湖羊生長性能的影響

2.2 添加氯化膽堿對湖羊瘤胃發酵參數和血漿TMAO含量的影響

如表3所示，添加氯化膽堿對瘤胃液pH沒有顯著影響(P=0.817)，也沒有顯著影響瘤胃揮發性脂肪酸(P>0.05)和氨氮含量(P=0.883)，但有增加血漿TMAO含量的趨勢(P=0.075)。

表3 添加氯化膽堿對湖羊瘤胃發酵參數和血漿TMAO含量的影響

2.3 添加氯化膽堿對湖羊瘤胃古菌和Mmc 16S rRNA基因以及細菌cutC基因豐度的影響

如表4所示，添加氯化膽堿沒有對瘤胃內容物中古菌16S rRNA基因(P=0.452)和細菌cutC基因(P=0.462)豐度產生顯著影響，但顯著提高了Mmc的16S rRNA基因(P=0.016)的豐度以及Mmc占古菌的比例(P=0.008)。

表4 添加氯化膽堿對湖羊瘤胃古菌和Mmc 16S rRNA基因以及細菌cutC基因豐度的影響

2.4 添加氯化膽堿對湖羊瘤胃菌群結構的影響

如表5所示，測序覆蓋度大于0.99，表明測序數據量可以代表樣品中的細菌菌群。添加氯化膽堿沒有顯著影響OTUs、Chao1、Shannon和Simpson指數(P>0.05)。PCoA結果顯示，添加氯化膽堿對瘤胃菌群結構產生了顯著影響(圖1，ANOSIM,P<0.009)。

相似性分析(ANOSIM)，P=0.009; 紅色: 試驗組,綠色: 對照組。

表5 添加氯化膽堿對湖羊瘤胃菌群α多樣性的影響

如圖2所示，在相對豐度大于0.1%的條件下，2個組共有9個門。2個組的優勢菌群主要為厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)。添加氯化膽堿未顯著影響細菌門水平上的相對豐度(P>0.05)。

Firmicutes:厚壁菌門；Bacteroidetes:擬桿菌門；Actinobacteria:放線菌門；Spirochaetae:螺旋體門；Candidate_division_TM7:被分類為細菌域候選TM7；Proteobacteria:變形菌門；Tenericutes:無壁菌門；Fibrobacteres: 纖維桿菌門；Cyanobacteria:藍藻菌門。

如圖3所示，相對豐度大于0.5%的屬有29個。2組優勢菌屬均為普雷沃氏菌屬(Prevotella)、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)、瘤胃球菌科中1個未分類的屬Unclassified S24-7和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)，這4個屬相對豐度均在5%以上。2組之間的細菌相對豐度在屬水平上無顯著差異(P>0.05)。

Syntrophococcus:互營球菌屬；Unclassified Erysipelotrichaceae:未分類丹毒絲菌科；Unlassified Veillonellaceae:未分類韋榮球菌科；Succiniclasticum:琥珀酸菌屬；Unclassified Lachnospiraceae:未分類毛螺菌科；Unclassified Christensenellaceae:未分類的克里斯滕森菌科；Roseburia:羅氏菌屬；Acetitomaculum:聚乙酸菌屬；Treponema:螺旋體菌屬；RC9_gut_group:理研菌科RC9 gut群；Unclassified Prevotellaceae:未分類普雷沃氏菌科；Lachnospiraceae-Incertae-Sedis:毛螺菌屬；Unclassiied Ruminococcaceae:未分類瘤胃球菌科；Ruminococcus:瘤胃球菌屬；Unclassified S24_7:未分類S24_7；Butyrivibrio:丁酸弧菌屬；Prevotella:普雷沃氏菌屬。

如圖4所示，當閾值設定為3.0時，通過LDA分析發現韋榮球菌科(Veillonellaceae)和Oribacterium在對照組中富集，擬桿菌科(Bacteroidaceae)、擬桿菌屬(Bacteroides)、柔膜菌綱(Mollicutes)、無壁菌門(Tenericutes)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、柔膜細菌RF9在試驗組中富集。

Veillonellaceae:韋榮球菌科；Rickettsiales:立克次氏體目；Quinella:奎因氏菌屬；Anaerovorax:厭氧弧菌屬；Enteroccus:腸球菌屬；Enterococcaceae:腸球菌科；Erysipelothrix:丹毒絲菌屬；Bacilli:芽孢桿菌屬；Lactobacillales:乳酸桿菌屬；Anaerotruncus:厭氧球菌屬；Rhodospirillales:紅螺菌目；Thalassospira:海旋菌屬；Rhodospirillaceae: 紅螺菌科；Betaproteobacteria:β-變形菌綱；Burkholderiales:伯克氏菌目；Parabacteroides:副擬桿菌屬；Porphyromonadaceae:紫單孢菌科；Enterobacteriaceae:腸桿菌科；Enterobacteriales:腸桿菌目；Escherichia-Shigella:埃希氏桿菌屬-志賀氏菌；Blautia:布勞特氏菌屬；Parasutterella:毛螺璇菌屬；Alcaligenaceae:產堿桿菌科；Gammaproteobacteria: γ-變形菌綱；Tenericutes:無壁菌門；Mollicutes:柔膜菌綱；Bacteroides:擬桿菌屬。

3 討 論

本研究在飼糧中添加0.05%的氯化膽堿沒有顯著影響湖羊的生長性能。膽堿在瘤胃中會被微生物快速降解成三甲胺，只有少量膽堿能夠到達小腸并被動物吸收[18]，因此添加的氯化膽堿基本不能被動物利用。添加的氯化膽堿對飼糧粗蛋白質增加量僅為0.031%，沒有對動物生長性能產生顯著影響。

添加0.05%的氯化膽堿沒有顯著影響湖羊瘤胃pH、VFA和氨氮含量，但改變了湖羊瘤胃細菌和甲烷菌菌群結構。Kelly等[19]通過利用膽堿三甲胺裂解酶檢索瘤胃微生物宏基因組數據，發現瘤胃中膽堿降解菌主要分布在放線菌門(Actinobacteria)、Firmicutes和變形菌門(Proteobacteria)3個門中，雖然分布較廣，但目前比對出來的7個細菌屬都不是瘤胃菌群中豐富和普遍的成員。瘤胃中主要的膽堿降解菌是歐爾森氏菌屬(Olsenellaumbonata)和Caecibacter，但主要菌屬存在動物物種差異，羊瘤胃中主要是Olsenella和Caecibacter，牛瘤胃中是Olsenella、Caecibacter和真桿菌屬(Eubacterium)。本研究湖羊瘤胃中Olsenella和Eubacterium的相對豐度均較低，未檢測到Caecibacter的存在，本研究的結果進一步證實了膽堿降解菌在瘤胃中并不是優勢菌群。本研究中對試驗組菌群變異貢獻最大的是擬桿菌門的擬桿菌屬和軟壁菌門的RF9，然而目前尚未發現在這2個門中有編碼膽堿三甲胺裂解酶的cutC基因分布[19-20]，引起這2個菌群變化的原因尚不清楚。這些變化的菌群可能與膽堿利用有關，如原蟲可利用瘤胃中游離膽堿合成自身的磷脂酰膽堿[21]，仍需進一步試驗證實。

添加氯化膽堿促進了瘤胃中Mmc甲烷菌的增殖。Mmc是瘤胃中利用三甲胺的主要甲烷菌[22]，這一甲烷菌的增殖暗示瘤胃中三甲胺增多，這表明添加的氯化膽堿在瘤胃中被降解為三甲胺。將膽堿降解為三甲胺和乙醛需要細菌膽堿三甲胺裂解酶的作用[6]，然而實時熒光定量PCR結果顯示瘤胃內容物中編碼膽堿三甲胺裂解酶的cutC基因豐度沒有顯著變化，這可能是由于添加的氯化膽堿未達到引起膽堿降解細菌增殖的量；另一個可能的原因是cutC基因的表達量增加了，然而本研究未能對此進行證實。

在血漿中檢測到TMAO，表明三甲胺從胃腸道轉移到了湖羊的血液循環。盡管飼糧中氯化膽堿含量增加促進了瘤胃中三甲胺利用菌Mmc甲烷菌的增殖，但由Mmc甲烷菌增殖而提升的三甲胺的利用能力未能完全抵消瘤胃中三甲胺增加的量，導致試驗組湖羊血漿中TMAO含量有升高的趨勢。這暗示飼糧中膽堿水平升高可能會導致更多的三甲胺進入動物機體，這可能會對動物健康造成潛在的危害。雖然未包被的氯化膽堿已經不在反芻動物的飼糧中使用，但飼料原料中含有豐富的三甲胺前體物質，如膽堿、甜菜堿、卵磷脂等。不同的飼料原料中這些物質含量不同，在飼料配方設計的時候需要綜合考慮，盡量減少瘤胃中三甲胺的生成，降低對動物健康的危害。

此外，目前在反芻動物飼料添加劑上廣泛使用的是過瘤胃氯化膽堿，但我們需要注意的是即便膽堿能夠到達小腸，大部分的膽堿也有可能不能被動物吸收利用。有文獻報道，到達小腸的膽堿僅有1/3被吸收進入腸細胞，2/3的膽堿被腸道微生物降解成三甲胺，以三甲胺的形式很快地被吸收進入門靜脈[4]。

4 結 論

添加0.05%的氯化膽堿未對湖羊生長性能和瘤胃發酵產生影響，但改變了瘤胃細菌和甲烷菌的菌群結構，有提高血漿中TMAO含量的趨勢，這一結果暗示飼糧中膽堿含量的變化能夠影響進入動物機體的三甲胺的量。進入機體的三甲胺增多，不但增加肝臟的解毒負擔，產生的TMAO還對動物的健康造成潛在的危害。