柑橘提取物對肥育豬腸道抗氧化指標、消化酶活性、氨態(tài)氮含量以及糞便氮、磷、臭氣含量的影響

崔藝燕 田志梅 鄧 盾 魯慧杰 劉志昌 王 剛 馬現(xiàn)永,2*

(1.廣東省農業(yè)科學院動物科學研究所，畜禽育種國家重點實驗室，農業(yè)農村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣東畜禽肉品質量安全控制與評定工程技術研究中心，廣州 510640；2.嶺南現(xiàn)代農業(yè)科學與技術廣東省實驗室茂名分中心，茂名 525000)

目前，我國已禁止在飼料中使用促生長類抗生素。然而，在集約化和規(guī)模化的高密度和高強度生產中，氧化應激和炎癥反應存在于整個養(yǎng)殖過程。促生長類抗生素的禁用，會導致養(yǎng)豬業(yè)產能下降。因此，為提高機體抗氧化能力和消化吸收功能，改善動物的生長性能和保證產品安全，同時減少糞污和臭氣排放，開發(fā)綠色健康的抗生素替代品是十分必要的。由于植物提取物的安全性和促生長作用，植物提取物已被考慮作為促生長類抗生素替代品。柑橘提取物具有來源穩(wěn)定、原料廉價易得等優(yōu)勢，充分利用柑橘產業(yè)廢棄物資源，減少合成化學品或抗生素的使用，是一種高效、健康的資源化利用策略，對養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

柑橘富含橙皮苷、柚皮苷、橘皮素和川陳皮素，是人類飲食中黃酮類化合物的關鍵來源[1]。柑橘提取物具有抗氧化[2]、抗炎[3]、抗菌[2]等多樣的活性功能，在制藥、食品和保健品等領域具有廣泛的應用，是潛在的飼用抗生素替代品之一。已有研究表明，柑橘提取物能夠預防過氧化氫誘導的氧化應激，減少活性氧的產生和膜脂過氧化[4]。柑橘提取物對豬痢疾短螺旋體菌株具有很好的殺菌效果[5]。此外，動物試驗表明，柑橘活性化合物可提高綿羊機體的抗氧化能力[6]。熱環(huán)境條件下，柚皮苷提高了羔羊平均日增重和飼料轉化率[7]。柚皮苷也可提高仔豬的增重、飼料轉化率以及營養(yǎng)物質消化率，改善生長性能[8]。柑橘提取物對肉雞[9]和仔豬[10-11]的免疫能力和腸道健康也有積極效果。

養(yǎng)豬過程中，動物糞便會排放出大量有害氣體、氮和磷，這會對動物和人類健康產生不利影響，另外，動物腸道不適會增加污染物的排放。通過改善腸道抗氧化能力，提高消化酶活性，增加動物對營養(yǎng)物質的利用，可減少氮、磷的排放，繼而減少臭氣的產生。目前，未見柑橘提取物在肥育豬生產的相關研究報道，尚不清楚柑橘提取物對豬腸道抗氧化功能有無不利影響，消化酶活性是增高或是降低，氮、磷和臭氣排放是否降低。因此，本研究評估了補充柑橘提取物對肥育豬腸道抗氧化指標、消化酶活性、氨態(tài)氮含量以及糞便氮、磷和臭氣含量的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

金霉素購自廣東某飼料科技有限公司，柑橘提取物由廣東某環(huán)保科技發(fā)展有限公司提供。柑橘提取物中含有3.04%維生素C、2.38%維生素E、2.89%檸檬酸和20.77%總黃酮。

1.2 試驗設計

選取108頭56日齡、體重(19.73±0.39) kg的“杜×長×大”肥育豬，公母各占1/2。按體重隨機分配到3個組，每個組6個重復，每個重復6頭豬。對照組飼喂基礎飼糧，抗生素組在基礎飼糧上添加75 g/t金霉素，柑橘提取物組在基礎飼糧上添加柑橘提取物(56～112日齡250 mL/t，113～194日齡200 mL/t)。試驗從仔豬體重20 kg左右開始，至120 kg左右結束。試驗期138 d。

1.3 基礎飼糧

基礎飼糧參照NRC(2012)營養(yǎng)需要配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗在廣東省農業(yè)科學院動物科學研究所豬場進行。根據(jù)豬場常規(guī)程序進行飼養(yǎng)管理。

1.5 樣品采集和處理

在試驗結束前1周的08:00—12:00收集新鮮糞便，一部分糞便用于測定臭氣含量；余下糞便按5%比例添加10%鹽酸進行固氮，然后65 ℃烘干72 h，-20 ℃保存。試驗結束，每組選取每欄接近平均體重的1頭肥育豬進行屠宰試驗，收集回腸、盲腸、結腸腸道內容物，待測氨態(tài)氮含量。清理腸段內容物后，用0.9%生理鹽水清洗腸段，再用載玻片刮取腸道(十二指腸、空腸、回腸)黏膜，-80 ℃保存。測定時，取約0.1 g腸道黏膜樣品，加入9倍體積生理鹽水制成10%組織勻漿液，4 ℃、3 500 r/min 離心15 min，取上清液進行測定。

1.6 指標測定

1.6.1 抗氧化指標

測定十二指腸、空腸、回腸黏膜樣品的丙二醛(MDA)含量、總抗氧化能力(T-AOC)及總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，以上指標測定試劑盒均購于南京建成生物工程研究所，采用多功能酶標儀測定，具體操作按說明書進行。

1.6.2 消化酶活性

測定十二指腸、空腸、回腸黏膜樣品的胃蛋白酶、胰蛋白酶、麥芽糖酶、蔗糖酶、脂肪酶、淀粉酶和堿性磷酸酶(AKP)活性，以上指標測定試劑盒均購于南京建成生物工程研究所，采用多功能酶標儀測定，具體操作按說明書進行。

1.6.3 氨態(tài)氮和糞便氮、磷含量

根據(jù)蒲萬霞等[12]的方法，采用靛藍酚藍分光光度法測定回腸、盲腸、結腸內容物中氨態(tài)氮含量。采用凱氏定氮法測定糞便氮含量，采用釩鉬黃比色法測定糞便磷含量。

1.6.4 糞便臭氣(硫化氫和氨氣)含量

使用手持泵式硫化氫檢測儀(H2S/C-200)和手持泵式氨氣檢測儀(NH3/CR-200)分別測定糞便硫化氫和氨氣含量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏法進行多重比較。結果用平均值±標準誤表示，P<0.05為差異顯著，0.05≤P<0.10為有差異趨勢。

2 結 果

2.1 柑橘提取物對肥育豬腸道抗氧化指標的影響

由表2可知，與抗生素組相比，柑橘提取物組十二指腸MDA含量降低了57.89%(0.05≤P<0.10)，且與對照組差異不顯著(P>0.05)；各間之間十二指腸其他抗氧化指標無顯著差異(P>0.05)。與抗生素組相比，柑橘提取物組空腸MDA含量顯著降低(P<0.05)，且與對照組差異不顯著(P>0.05)；各間之間空腸其他抗氧化指標無顯著差異(P>0.05)。各間之間回腸抗氧化指標無顯著差異(P>0.05)。

表2 柑橘提取物對肥育豬腸道抗氧化指標的影響

2.2 柑橘提取物對肥育豬腸道消化酶活性的影響

由表3可知，與對照組相比，柑橘提取物組十二指腸胃蛋白酶活性顯著提高(P<0.05)，脂肪酶活性顯著提高(P<0.05)，淀粉酶活性顯著降低(P<0.05)。柑橘提取物組十二指腸消化酶活性與抗生素組差異不顯著(P>0.05)。與對照組和抗生素組相比，柑橘提取物組空腸胃蛋白酶活性顯著提高(P<0.05)，淀粉酶活性顯著降低(P<0.05)；與對照組相比，柑橘提取物組空腸胰蛋白酶活性顯著提高(P<0.05)，且與抗生素組差異不顯著(P>0.05)。與對照組相比，柑橘提取物組回腸淀粉酶活性顯著降低(P<0.05)；抗生素組回腸淀粉酶活性與對照組和柑橘提取物組差異均不顯著(P>0.05)。

表3 柑橘提取物對肥育豬腸道消化酶活性的影響

2.3 柑橘提取物對肥育豬腸道氨態(tài)氮含量和糞便氮、磷含量的影響

由表4可知，各組之間腸道氨態(tài)氮含量和糞便氮、磷含量無顯著差異(P>0.05)。在數(shù)值上，柑橘提取物組回腸、盲腸、結腸的氨態(tài)氮含量最低。

表4 柑橘提取物對肥育豬腸道氨態(tài)氮含量和糞便氮、磷含量的影響

2.4 柑橘提取物對肥育豬糞便臭氣含量的影響

由表5可知，各組之間新鮮糞便氨氣和硫化氫含量無顯著差異(P>0.05)。在數(shù)值上，柑橘提取物組肥育豬新鮮糞便氨氣和硫化氫含量最低。各組之間24 h內糞便氨氣和硫化氫含量無顯著差異(P>0.05)。

表5 柑橘提取物對肥育豬糞便臭氣排放的影響

3 討 論

3.1 柑橘提取物對肥育豬腸道抗氧化指標的影響

腸道是機體消化吸收的主要場所，消化酶分解食物的同時會產生各種致氧化因子，這使得腸道容易處于氧化應激狀態(tài)[13]。SOD、GSH-Px和CAT是體內重要的抗氧化酶[14]，是反映機體抗氧化能力的重要指標。T-AOC是反映機體抗氧化能力的綜合指標。MDA是機體內氧化損傷的指標[14]。抗氧化劑系統(tǒng)不僅可以防止脂質和蛋白質氧化引起的損傷，還可以保持腸道屏障完整性，防止細菌感染[15]。本研究中，抗生素組空腸MDA含量顯著高于對照組和柑橘提取物組，說明長期攝入抗生素對腸道健康有負面作用。與抗生素組相比，飼糧中添加柑橘提取物降低了十二指腸、空腸和回腸MDA含量，這表明柑橘提取物對機體抗氧化能力優(yōu)于抗生素。本研究中，飼糧中添加柑橘提取物未能提高腸道抗氧化酶活性，而腸道MDA含量降低的原因可能是抗氧化系統(tǒng)中抗氧化物質(谷胱甘肽、維生素E、維生素C)含量提高造成的。迄今為止，鮮有研究報道柑橘提取物對動物腸道抗氧化能力的影響，多以純化柑橘化合物研究為主。Bakar等[14]研究表明，柚皮苷降低了大鼠小腸MDA含量，增加了小腸SOD和GSH-Px活性。Guo等[16]報道，橙皮苷通過降低腸道MDA含量，增強腸道SOD活性和谷胱甘肽含量來改善結腸炎。這些研究均是以腸道受損動物模型進行研究，在應激狀態(tài)下柑橘黃酮化合物表現(xiàn)出較好的抗氧化效果，但是這些研究未報道動物生長性能的相關數(shù)據(jù)。機體具有自我調節(jié)功能，柑橘提取物可能改善了機體其他功能。在前期試驗中，與抗生素相比，柑橘提取物對仔豬生長性能和腸道抗氧化能力無顯著影響，但能改善仔豬血液和腸道的免疫功能[10-11]，減少疾病的發(fā)生和藥物的使用，對于豬群健康十分有利，有利于推廣應用。

3.2 柑橘提取物對肥育豬腸道消化酶活性的影響

消化吸收不良會嚴重影響動物的生長和健康。小腸是營養(yǎng)物質消化吸收的主要部位[15]。消化酶在營養(yǎng)物質消化過程中起重要作用。Pi等[17]研究發(fā)現(xiàn)，抗生素不影響生長豬腸道消化酶活性。黃酮類化合物能調節(jié)腸道參與脂質和碳水化合物消化吸收的酶活性[18]。脂肪酶負責脂肪消化，是動物脂質利用的指標[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，柑橘提取物組十二指腸胃蛋白酶、脂肪酶活性顯著提高，空腸胃蛋白酶活性顯著提高。Yang等[20]研究表明，有機酸精油混合物提高了肉雞腸道胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶活性。課題組前期結果顯示，柑橘提取物提高了仔豬腸道蛋白酶和脂肪酶活性[10]。柑橘提取物對仔豬和肥育豬消化酶活性的影響一致。蛋白酶活性的提高，可能是由于柑橘提取物刺激消化酶的分泌，激活了蛋白酶原。傅曼琴等[21]認為，川陳皮素、橘皮素及與橙皮苷組合可促進胃蛋白酶的分泌，并提高胃蛋白酶活性。蛋白酶活性提高可在腸道中產生更多的游離氨基酸，總體上提高蛋白質的消化利用率。柑橘提取物提高脂肪酶活性，使得產生的游離脂肪酸和甘油酯含量增加，提高脂肪消化吸收利用率，促進機體生長。

碳水化合物在腸道中被消化成葡萄糖并被吸收到體內，淀粉酶活性可以反映消化吸收的狀態(tài)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，飼糧中添加柑橘提取物降低了肥育豬十二指腸、空腸和回腸淀粉酶的活性，與以往研究結果[23]一致。Shen等[24]研究發(fā)現(xiàn)，柑橘黃酮顯著抑制淀粉酶催化的淀粉消化，柚皮苷和新橙皮苷抑制直鏈淀粉消化，橙皮苷和川陳皮素抑制直鏈淀粉和支鏈淀粉的消化。淀粉酶活性受抑制，降低了機體對碳水化合物的消化，分解產生的葡萄糖會減少，可能影響動物健康。但是，本試驗中柑橘提取物未降低肥育豬生長性能，這可能是由于淀粉酶活性降低，直鏈淀粉的消化減慢，導致到達后腸的直鏈淀粉含量增加，有利于微生物的生長代謝，繼而產生高水平的短鏈脂肪酸，調控后腸代謝并改善動物健康[25]。另一種解釋是，淀粉酶活性下降，中間產物麥芽糖含量減少，而在麥芽糖酶活性不變的條件下，碳水化合物的消化時間延長了，能產生足夠量的葡萄糖為機體提供能量。在仔豬試驗中，未發(fā)現(xiàn)柑橘提取物降低腸道淀粉酶活性[10]。仔豬消化系統(tǒng)未發(fā)育成熟，消化機能不完善。仔豬和肥育豬的腸道消化酶活性是不同的。柑橘黃酮類化合物在消化、吸收和分配過程的各個階段的相互作用，對不同的消化酶產生不同的效果。總體上柑橘提取物改善了蛋白酶和脂肪酶活性，對機體營養(yǎng)物質消化吸收產生積極效果。柑橘提取物未表現(xiàn)出較好的促生長作用，與酶活性的提高不符，這可能是由于淀粉酶活性下降引起的，也可能是添加劑量以及使用時間造成的。目前的研究缺乏蛋白質、脂肪等營養(yǎng)物質消化率的研究，因此必須通過進一步試驗來解釋柑橘提取物對生長性能的影響。

3.3 柑橘提取物對肥育豬腸道氨態(tài)氮含量及糞便氮、磷含量的影響

腸道氨態(tài)氮含量過高對腸道健康有害。與抗生素組和對照組相比，柑橘提取物組腸道氨態(tài)氮含量降低了22.95%～36.48%。這可能是由于提取物中的類黃酮化合物引起的，也可能是蛋白質消化率的提高(蛋白酶活性提高)或微生物菌群導致的。

在養(yǎng)豬生產中，飼料消化效率低下會導致營養(yǎng)物質的排放增加。氮、磷排放的問題主要與豬和家禽的生產有關，育肥期生豬排泄物總量和氮含量比其他階段的豬要高，氨氣的排放量也高[26]。高含量的氮、磷排放到水體中，易造成富營養(yǎng)化，對動物和人類產生潛在健康危害[27]。本研究提示，柑橘提取物改善了腸道蛋白酶的活性，即機體吸收的蛋白質含量增加，則排出的氮含量減少。但是研究未發(fā)現(xiàn)糞便氮含量的減少，這是由于機體氮的吸收代謝并不能完全由蛋白酶活性的增加而決定，還受到其他酶系、內源性氮和微生物代謝等的影響。另外，糞便氮主要來源于未消化的飼糧氮、未被消化的微生物氮和內源氮，超過動物需要的氮一般通過尿液排出[28]。由于試驗限制，未對尿液進行氮、磷含量的測定。后續(xù)若條件允許，應當進行消化代謝試驗，以準確定量排泄物氮的排放，探討柑橘提取物是否通過尿氮的形式實現(xiàn)減排。磷是動物體內含量最多的常量元素之一，主要存在于糞便中，尿液中較少[29]。暫未發(fā)現(xiàn)有關柑橘提取物對尿液氮、磷排放影響的研究，為了達到更好的減排效果，柑橘提取物對肥育豬氮、磷排放的影響需要更多后續(xù)試驗研究。

3.4 柑橘提取物對肥育豬糞便臭氣含量的影響

氨氣和硫化氫是豬糞臭氣的主要成分[30]，易引起動物呼吸道和組織損傷，損害機體健康，隨接觸時間的延長顯著降低動物生長性能[31]。臭氣的減少有利于動物生長性能的提高，通過營養(yǎng)調控減少臭氣排放是經濟可行的。與抗生素組相比，柑橘提取物組糞便氨氣含量減少了約17%。這可能由于較高的蛋白酶活性改善了蛋白質消化率，減少了大腸中微生物的發(fā)酵底物，減少糞便氨氣的排放。Lei等[32]研究表明，草藥提取物對生長豬營養(yǎng)物質消化率和氣體排放無顯著影響。糞便臭氣的排放與環(huán)境、飲食、營養(yǎng)狀況等相關。研究表明，豬舍氨氣含量小于20 mg/m3，對豬生長和健康無顯著影響[33]。本試驗中糞便氨氣含量均低于20 mg/m3，可見本試驗豬群生長環(huán)境較好，對豬健康生長無負面影響。

糞便含氮物在微生物作用下轉化為氨態(tài)氮，是氨氣的主要來源[33]，隨時間的延長，氨氣排放呈先上升后下降的趨勢[34]。糞便排出后一般在24 h內被清理，因此本試驗對存放24 h的糞便進行了臭氣的測定，發(fā)現(xiàn)柑橘提取物對存放后的糞便臭氣排放無顯著影響，24 h糞便的氨氣含量高于新鮮糞便。由于缺乏尿液臭氣含量數(shù)據(jù)，目前尚不清楚柑橘提取物是否具有脲酶抑制劑的作用，能否減緩尿素或其他含氮物分解產生氨氣的速度。低pH能破壞氨態(tài)氮轉化氨氣的化學平衡，減少氨氣形成[35]。有研究報道，降低pH可減少肥育豬70%氨氣的排放量[36]。但本試驗中柑橘提取物未能降低糞便pH。這可能是由于添加劑量不足以改變腸道pH，也有可能是柑橘提取物并不是通過降低腸道pH實現(xiàn)氨氣的減排。另外，臭氣的產生與腸道微生物發(fā)酵、pH密切相關，不清楚柑橘提取物達到后腸被微生物利用的程度，是否改變了菌群結構。目前缺乏足夠的研究探討柑橘提取物對臭氣減排的機理。

4 結 論

柑橘提取物改善了肥育豬腸道蛋白酶和脂肪酶活性，降低了淀粉酶活性，對腸道抗氧化能力及糞便氮、磷和臭氣排放無負面影響。