飼糧添加凹凸棒石負載植物精油復合物對蛋雞生產性能和腸道微生物的影響

程 浩 唐圣果* 賀長青 郭松長 陳繼發 曲湘勇*

(1.湖南農業大學動物科學技術學院，長沙 410128；2.宜春學院生命科學與資源環境學院，宜春 336000)

近年來，抗生素在動物養殖中濫用，致使細菌耐藥性、食品安全和藥物殘留問題日益突出。自2020年7月1日起，我國全面禁止在動物飼料中添加促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)。飼料禁抗后對動物腸道健康和生產性能會帶來一定負面影響[1]。因此，尋找安全、有效的飼用抗生素替代品已成為畜牧業健康發展的重要課題。當動物腸道被大量病原菌侵襲時，過度繁殖的病原菌會造成腸道菌群失衡，破壞腸黏膜屏障功能，降低機體免疫能力，進而降低動物生產性能，甚至增加死亡率[2]。百里香酚和香芹酚是芳香植物精油的主要成分，對細菌、真菌和病毒均有一定抑制作用，在食品、化妝品和動物養殖等方面有著較廣泛的應用[3-4]。但由于植物精油難溶于水、揮發性強、分子結構對環境敏感、耐熱性差等原因，需要改善植物精油的穩定性以提高其應用效果[5]。凹凸棒石是一種鏈層狀結構黏土，因其吸附能力強、比表面積大、具有催化性等特性，常被作為載體應用于工業和動物營養領域[6-7]。楊勇等[8]報道，將銀(Ag)、溴化銀(AgBr)和二氧化鈦(TiO2)等無機物負載于凹凸棒石，結合后產物的抑菌效果較凹凸棒石顯著增強。Lei等[9]研究指出，改性凹凸棒石與姜精油復合物比單純的姜精油表現出更好的抗菌性能，且有靶向抑菌能力；此外，該復合物具有很好的熱穩定性和耐酸堿性。本研究以凹凸棒石為載體，負載植物精油，將多種活性成分通過工藝制備，組裝成凹凸棒石負載植物精油復合物(essential oil/palygorskite composite，EO-PGS)，推測其能夠有效抑制腸道有害菌，優化腸道菌群結構，改善腸道健康，進而提高蛋雞生產性能。因此，本試驗旨在探討飼糧添加不同水平EO-PGS對蛋雞生產性能和腸道微生物的影響，以期為其在蛋雞生產中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用EO-PGS由江蘇某生物科技股份有限公司提供，其主要成分含量為：凹凸棒石>70%，植物精油(百里香酚精油和香芹酚精油等)>15%，其他礦物元素<15%。利用凹凸棒石的納米特性，通過凹凸棒石表面改性、電荷調控、抗菌因子組裝、表面交聯等工藝制備EO-PGS。

1.2 試驗設計與飼養管理

選取480只65周齡、體重相近、健康的羅曼粉殼蛋雞，隨機分成4組，每組6個重復，每個重復20只雞。預試期各組統一飼喂基礎飼糧。正試期對照組飼喂基礎飼糧，試驗組分別飼喂在基礎飼糧中添加0.50、0.75和1.00 g/kg EO-PGS的試驗飼糧。基礎飼糧參考《雞飼養標準》(NY/T 33—2004)并結合生產實際配制，基礎飼糧組成及營養水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

試驗雞采用雙層階梯式籠養，飼養于上、下2層，每籠4只，每5籠為1個重復；飼養管理按照雞場常規管理程序進行。試驗雞自由采食和飲水，預試期7 d，正試期56 d。

1.3 生產性能的測定

正試期內，每日以重復為單位記錄各組產蛋數、蛋重、軟破殼蛋數及死淘雞數，每周統計1次采食量，計算統計期內的產蛋率、平均蛋重、死淘率、料蛋比、日產蛋重和平均日采食量。

1.4 腸道內容物樣品采集

試驗第56天，每個重復隨機選取1只接近平均體重的雞，放血死亡后，剖開腹腔，取十二指腸和盲腸內容物樣品置于2 mL凍存管中，于-80 ℃保存。

1.5 腸道內容物微生物相對豐度的測定

選取十二指腸和盲腸內容物樣品180～220 mg，采用糞便基因組DNA提取試劑盒(DP328，天根生化科技有限公司)提取腸道內容物DNA，嚴格按照試劑盒說明進行操作。用超微量分光光度計(NanoDrop ND-2000 UV，Thermo Fisher Scientific公司，美國)檢測DNA濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測純度。

每個DNA樣品的濃度檢測3次，計算平均值，將24個DNA樣品的濃度統一稀釋至100 ng/μL。使用熒光定量PCR試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]并參照其說明書進行熒光定量PCR擴增，反應體系為10 μL：SYBR 5.0 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，DNA 1.0 μL，雙蒸水3.2 μL。反應程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；60 ℃ 40 s，39個循環；在65～95 ℃繪制熔解曲線。引物采用Primers軟件設計，由上海生工生物有限公司合成，引物序列見表2，所有引物經特異性檢測合格后再使用。以總菌為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的細菌的相對豐度[10]。

表2 引物序列

1.6 盲腸菌群多樣性和菌群結構分析

數據優化：使用Trimmomatic軟件原始測序序列進行質控，使用Flash v1.2.11軟件進行拼接：對經過雙端(pair-end)測序的數據進行質量控制，截斷或舍棄低質量序列(50個連續堿基平均質量>Q30，接頭污染、含有N堿基的reads)。利用軟件Uparse 7.0.1090，根據97%的相似度對序列進行操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)聚類，使用UCHIME軟件剔除嵌合體。選取每個類最長的序列為代表序列，通過RDP-Classifier v2.11軟件將OTU代表序列與數據庫有比對進行物種注釋，得到每個OTU的分類學信息。通過軟件Mothur 1.30.2和Qiime 1.9.1對生成的OTU信息進行細菌群落多樣性和豐富度分析。

1.7 數據統計與分析

微生物測序數據采用SAS 9.2統計軟件進行Kruskal-Wallis秩和檢驗，生產性能和微生物相對豐度數據進行單因素方差分析，差異顯著者采用Duncan氏法進行多重比較。試驗結果以平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著，0.05≤P<0.10表示有提高或降低的趨勢。

2 結果與分析

2.1 EO-PGS對蛋雞生產性能的影響

由表3可知，試驗組蛋雞的產蛋率較對照組均有所提高，其中0.75和1.00 g/kg EO-PGS組的產蛋率顯著高于對照組(P<0.05)。各組間平均日采食量、平均蛋重、日產蛋重、料蛋比和死淘率均差異不顯著(P>0.05)。

表3 EO-PGS對蛋雞生產性能的影響

2.2 EO-PGS對蛋雞盲腸菌群α多樣性的影響

由表4可知，各組樣品測序覆蓋率均在99.5%以上，說明測序深度已經基本覆蓋到樣品中的所有物種。各組樣品測序獲得的有效序列和盲腸菌群Shannon指數、Simpson指數、Ace指數、Chao指數均無顯著差異(P>0.05)。

表4 EO-PGS對蛋雞盲腸菌群α多樣性的影響

2.3 EO-PGS對蛋雞盲腸菌群β多樣性的影響

β多樣性分析可以比較不同樣品間在物種多樣性方面存在的差異大小。如圖1所示，經主坐標分析(PCoA)，結果顯示對照組和0.50 g/kg EO-PGS組菌群結構分布相對緊湊，相似度較高，而0.75和1.00 g/kg EO-PGS組菌群結構分布相對零散，相似度低，群落構成差異較大。

A：對照組 control group；B：0.50 g/kg EO-PGS組 0.50 g/kg EO-PGS group；C：0.75 g/kg EO-PGS組 0.75 g/kg EO-PGS group；D：1.00 g/kg EO-PGS組 1.00 g/kg EO-PGS group。

2.4 EO-PGS對蛋雞盲腸菌群結構和物種豐度的影響

由表5可知，在門水平上，各組中擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門均為優勢菌門，其中擬桿菌門和厚壁菌門相對豐度分別為45.43%～53.27%和38.39%～46.14%。對照組盲腸中相對豐度排第4的菌門為螺旋體門，而0.50、0.75和1.00 g/kg EO-PGS組為放線菌門。統計結果表明，各組間優勢菌門相對豐度均無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，試驗組軟壁菌門相對豐度有提高的趨勢(P=0.071)，0.50和0.75 g/kg EO-PGS組迷蹤菌門相對豐度顯著提高(P<0.05)。

表5 相對豐度大于0.15%(序列占測序總量比例)的菌門

由表6可知，在相對豐度大于0.7%的菌屬中，各組中擬桿菌屬和考拉桿菌屬均為優勢菌屬。統計結果表明：各組間優勢菌屬沒有顯著差異(P>0.05)；與對照組相比，0.50和0.75 g/kg EO-PGS組Elusimicrobium相對豐度顯著提高(P<0.05)，0.50 g/kg EO-PGS組優桿菌屬相對豐度顯著提高(P<0.05)。此外，與對照組相比，試驗組雙歧桿菌屬和乳桿菌屬相對豐度均有不同程度的提高(P>0.05)，志賀氏菌屬相對豐度有不同程度的降低(P>0.05)。

表6 相對豐度大于0.7%(序列占測序總量比例)或差異顯著的菌屬

2.5 EO-PGS對蛋雞腸道內容物微生物相對豐度的影響

由表7可知，與對照組相比，試驗組十二指腸雙歧桿菌相對豐度有提高的趨勢(P=0.065)，0.50 g/kg EO-PGS組乳酸桿菌相對豐度顯著提高(P<0.05)。與對照組相比，試驗組盲腸雙歧桿菌相對豐度顯著提高(P<0.05)，沙門氏菌相對豐度顯著降低(P<0.05)，0.50 g/kg EO-PGS組乳酸桿菌相對豐度顯著提高(P<0.05)，0.50和1.00 g/kg EO-PGS組大腸桿菌相對豐度顯著降低(P<0.05)。

表7 EO-PGS對蛋雞腸道微生物相對豐度的影響

3 討 論

3.1 EO-PGS對蛋雞生產性能的影響

研究表明，植物精油具有抑菌、抗炎、增強免疫等多種生物學功能，飼糧添加植物精油對蛋雞生產性能有積極作用[11-12]。Wang等[13]研究表明，飼糧添加植物精油混合物可以提高蛋雞產蛋率，一定程度上降低料蛋比。Akbari等[14]研究發現，薄菏精油和百里香精油能有效緩解蛋雞因寒冷引起的生產性能下降，提高產蛋率。此外，Qiao等[15]研究表明，飼糧添加天然凹凸棒石和熱改性凹凸棒石均可改善蛋雞的消化功能，一定程度上提高產蛋率和蛋品質。本研究發現，飼糧添加0.50、0.75和1.00 g/kg EO-PGS提高了蛋雞產蛋率，一定程度上降低了死淘率和料蛋比。目前，已有較多學者開展了植物精油和凹凸棒石單獨應用于蛋雞生產中的研究，盡管試驗結果存在差異，但總體上表明它們能在不同程度上提高蛋雞的生產性能[13-15]，本試驗結果與前人的報道基本相符。

3.2 EO-PGS對蛋雞盲腸菌群多樣性的影響

研究表明，宿主與腸道微生物之間互利共生，宿主自身的生長狀況影響腸道微生物的生長定植，同時腸道微生物可以參與宿主營養物質的消化吸收，微生物多樣性的增加有利于提高機體免疫功能[16]。本試驗中，試驗組蛋雞盲腸菌群有效序列和對照組之間無顯著差異，但試驗組樣品中反映α多樣性的Shannon指數均高于對照組，Simpson指數均低于對照組，說明試驗組樣品中微生物菌群更豐富；根據PCoA中β多樣性發現，0.75和1.00 g/kg EO-PGS組菌群結構分布相對零散，相似度低，群落構成差異較大，說明微生物的多樣性有一定提高。張超[17]基于16S rDNA高通量測序分析腸炎小鼠腸道微生物多樣性，結果發現，與正常小鼠相比，炎癥性腸病小鼠腸道微生物菌群結構紊亂，腸道菌群多樣性降低；經植物精油治療后，腸炎小鼠腸道微生物多樣性提高。辛洪亮[18]采用PCR-變性梯度凝膠電泳(DGGE)及DNA測序技術研究植物精油混合物對肉雞腸道微生物多樣性的影響，發現前期、后期和全期添加精油對腸道微生物多樣性均無顯著影響，這與本試驗結果基本一致。

3.3 EO-PGS對蛋雞盲腸菌群結構和物種相對豐度的影響

家禽腸道微生物數量多，組成結構復雜，前人研究發現，家禽的腸道菌群主要由擬桿菌門和厚壁菌門組成[19]。本試驗結果表明，蛋雞盲腸菌群以擬桿菌門和厚壁菌門占絕對優勢，二者相對豐度在90%以上，且添加EO-PGS后2個優勢菌門的相對豐度沒有顯著變化，可能與健康的成年蛋雞腸道中已經形成較穩定的微生物區系有關，雖然EO-PGS可能在腸道內抑制部分有害菌如大腸桿菌、沙門氏菌的增殖，但很難引起腸道主要微生物發生很大變化。研究指出，糖代謝異常和非酒精性脂肪肝小鼠腸道中軟壁菌門的相對豐度降低，機體血脂異常和炎癥程度都有所加劇[20-21]。麥云珮等[22]報道，香芹酚可有效降低1型糖尿病小鼠血液中葡萄糖含量，改善機體糖脂代謝。本試驗發現，試驗組軟壁菌門相對豐度有提高的趨勢且呈劑量效應，且香芹酚是EO-PGS的主要組成成分，提示EO-PGS可能具有調節腸道菌群結構，改善糖代謝的作用。黃飛[23]研究了高脂飼糧誘導的SD大鼠模型腸道菌群結構的變化，發現模型組血液大鼠高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)含量顯著降低，血液低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)含量顯著升高，糖代謝出現異常，腸道菌群樣本相對豐度和多樣性顯著降低，厚壁菌門和迷蹤菌門相對豐度顯著降低，腸屏障修復能力下降；經復方中藥治療后，腸道菌群多樣性顯著提高，腸道屏障修復能力得到恢復。本研究結果顯示，0.50和0.75 g/kg EO-PGS組迷蹤菌門的相對豐度顯著提高，進一步說明EO-PGS可能具有調節腸道菌群結構和改善糖代謝的作用。

在屬水平上，飼糧添加EO-PGS對盲腸優勢菌屬相對豐度沒有顯著差異。與對照組相比，試驗組Elusimicrobium相對豐度顯著升高。研究發現，Elusimicrobium可產生醋酸鹽和丙氨酸，這可能對肝損傷和葡萄糖-丙氨酸循環有益[24]。Shi等[25]報道，飼糧添加乳桿菌和片球菌后，肝硬化小鼠癥狀得到改善，肝臟和腸道中炎癥因子含量減少，Eluximicrobium和普雷沃菌屬等潛在有益菌的相對豐度提高，且與白細胞介素-6和白細胞介素-17含量呈高度負相關。本研究表明，0.75和1.00 g/kg EO-PGS組盲腸菌群中乳桿菌屬和普雷沃菌相對豐度均高于對照組。這提示EO-PGS可能與有益菌一樣，具有降低機體炎癥反應、調節腸道菌群結構的作用。此外，試驗組腸道中優桿菌屬相對豐度較對照組均有不同程度提高，其中0.50 g/kg EO-PGS組優桿菌屬相對豐度顯著提高。研究表明，優桿菌屬包含眾多產丁酸鹽菌群，是一種有益于宿主健康的菌屬[26-27]。朱林文思[28]研究發現，結腸癌患者中腸道優桿菌屬相對豐度較低的患者，術后再發的風險較大。這提示EO-PGS可能具有增強腸道免疫的作用。同時，本研究也發現添加EO-PGS后，試驗組其他菌屬的物種相對豐度有所改變，但在統計學上無顯著差異，不能作為評判EO-PGS是否影響腸道菌群結構和物種相對豐度的標志。

3.4 EO-PGS對蛋雞腸道內容物微生物相對豐度的影響

腸道病原菌的過度繁殖容易引起腸道屏障受損和腸道炎癥，影響腸道健康[29-30]。研究表明，植物精油能夠通過破壞細胞膜和細胞壁，影響蛋白質和DNA合成等多種途徑來發揮抑菌作用[31-32]。Tiihonen等[33]研究發現，飼糧添加15 g/t的百里香酚和5 g/t肉桂醛植物精油，肉雞盲腸內大腸桿菌數量顯著降低，乳酸桿菌數量顯著增加。韓旭[34]研究發現，牛至油能夠顯著提高蛋雞雙歧桿菌和乳酸桿菌數量，同時降低大腸桿菌和沙門氏菌數量，一定程度上改善腸道功能，促進腸道健康。此外，有研究指出，凹凸棒石內部存在強大的庫侖場和極性，具有很強的吸附性，能夠吸附大腸桿菌和假單胞菌等致病菌[35]。本研究結果顯示，試驗組蛋雞盲腸內容物中沙門氏菌和大腸桿菌相對豐度均低于對照組；0.50 g/kg EO-PGS組盲腸和十二指腸乳酸桿菌相對豐度顯著提高，試驗組盲腸和十二指腸雙歧桿菌相對豐度均有所提高，這與前人研究結果基本一致，提示飼糧中添加EO-PGS能夠優化蛋雞腸道菌群結構，改善腸道健康。

研究表明，腸道有害菌數量的減少和有益菌數量的增多對動物生產性能有積極作用，可能是因為削弱了有害菌與宿主之間對營養物質的競爭、減少了因致病菌過度繁殖引起的腸道疾病以及促進有益菌代謝物的產生改善腸道屏障功能[36-37]。綜上所述，有害菌(大腸桿菌和沙門氏菌)數量的降低和有益菌(乳酸桿菌和雙歧桿菌)數量的增加以及腸道微生物多樣性的一定程度的提高可能是本試驗中蛋雞產蛋性能改善的一個重要原因。

4 結 論

飼糧添加0.75和1.00 g/kg EO-PGS可以顯著提高蛋雞產蛋率；飼糧添加EO-PGS能夠在一定程度上提高蛋雞腸道微生物多樣性，調節腸道菌群結構。