葉酸和維生素B12對產蛋雞生產性能、小腸屏障功能及相關基因表達的影響

武笑天 溫 曌 李銳瑞 白 彥 王 瑞 楊 玉

(山西農業大學動物科學學院，太谷 030801)

葉酸又名蝶酰谷氨酸，是畜禽生長發育過程中一種重要的水溶性B族維生素。作為一碳單位的受體和供體，葉酸參與動物機體DNA、RNA及各種蛋白質的合成[1]，能夠影響細胞因子的形成，進而提高動物機體的免疫力。維生素B12可以以輔酶的形式提高葉酸的利用率，促進碳水化合物、脂肪和蛋白質的代謝[2]。腸道作為營養物質吸收的主要場所，其健康發育對家禽生長至關重要。而家禽腸道健康與腸道黏膜屏障功能密切相關。尹秀玲等[3]研究表明，飼糧添加0.4、0.5、0.6和1.0 mg/kg葉酸時，雛雞的體重隨之增加，而葉酸缺乏可引起雛雞免疫力下降，死亡率提高。丑武江等[4]研究表明，飼糧添加3 mg/kg葉酸可顯著提高肉仔雞的平均日增重和平均日采食量，提高血清中蛋白質的含量，降低料重比。飼糧添加10 mg/kg維生素B12顯著提高了5～15周齡五龍鵝空腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度(V/C)值，顯著降低了空腸隱窩深度[5]。3周齡肉仔雞飼糧中分別添加0.75 mg/kg葉酸和300 mg/kg甜菜堿以及2.25 mg/kg葉酸和300 mg/kg甜菜堿，肉仔雞飼料轉化率和平均日增重均隨著葉酸添加水平的提高而提高[6]。京紅蛋雞營養標準中葉酸和維生素B12的推薦量分別為1.5 mg/kg和25～30 μg/kg。有關葉酸和維生素B12缺乏的研究較多，而補充多少葉酸和維生素B12可獲得較好的腸道免疫性能，仍處于空白。因此，本試驗在飼糧中添加不同水平的葉酸和維生素B12，研究其對產蛋高峰期京紅蛋雞生產性能、蛋品質、小腸屏障功能及相關基因表達的影響，為調控產蛋雞免疫性能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計和飼糧

試驗選擇972只28周齡健康狀況良好、處于產蛋高峰期的京紅蛋雞，隨機分成9組，每組6個重復，每個重復18只雞。采用2因素3水平試驗設計，在基礎飼糧中分別添加0、2和5 mg/kg葉酸和0、25和75 μg/kg維生素B12，基礎飼糧組成及營養水平見表1，試驗設計見表2。維生素B12由河北某生物工程股份有限公司提供，其有效成分含量≥1%；葉酸由河北某生物科技有限公司提供，其有效成分為95.5%～102.0%。試驗預試期2周，飼喂基礎飼糧，期間各組蛋雞產蛋率無顯著差異(P>0.05)后開始試驗，正試期8周。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

表2 試驗設計

1.2 飼養管理

采用3層階梯式籠養，每籠3只雞，連續的6籠為1個重復，各重復均勻分布于雞舍同行中間2層。全程粉料飼養，每天光照時間為16 h，雞舍溫度控制在25 ℃左右，自由飲水，每天喂食2次(09:00和15:00)，自然通風和縱向負壓通風相結合，每天16:30揀蛋并記錄稱重。其他均按養殖場常規方法進行。

1.3 樣品采集處理和指標測定

1.3.1 生產性能

試驗期間以各重復為單位記錄每日采食量、產蛋總數、總蛋重、軟破蛋數和死淘數，每周計算各組的料蛋比和產蛋率。

1.3.2 蛋品質

試驗期間，每周每個重復選取3枚接近平均蛋重的雞蛋(n=18)，測定蛋形指數、蛋殼強度、蛋殼厚度、蛋黃顏色、哈氏單位、蛋白高度、平均蛋重、蛋黃重及蛋殼重。所用儀器為全自動蛋品分析儀(EA-01,以色列)、ORKA蛋殼強度儀(EFO-501,以色列)、蛋殼厚度儀(MODEL-1061,日本)和數顯千分尺(MODEL-P-1)。

1.3.3 小腸組織形態

試驗結束時，每重復選取1只雞，每組6只雞，禁食12 h，采用無菌操作分別取十二指腸、空腸和回腸的同一部位放于75%的中性甲醛中，在4 ℃環境中保存。按照常規方法制作石蠟切片，利用Image-Pro Plus軟件測量小腸各部位絨毛高度和隱窩深度，并計算V/C值。每個樣本觀察2個非連續切片，每張切片選取3個視野，每個視野分別測定10組數據，其平均值作為1個測定數據。

1.3.4 小腸總RNA提取和反轉錄

雞頸靜脈放血致死，采用無菌操作迅速取出十二指腸、空腸和回腸同一部位放入液氮中，置于-80 ℃待測。采用Trizol法分別提取十二指腸、空腸和回腸組織總RNA。用核酸蛋白儀測定RNA完整性、濃度和純度。按照反轉錄試劑盒說明合成cDNA，-20 ℃保存備用。

1.3.5 引物設計

根據NCBI測序數據庫中閉鎖蛋白(occludin)、閉合蛋白-1(claudin-1)、閉合小環蛋白-1(ZO-1)、黏蛋白2(MUC2)、Toll樣受體4(TLR4)、核轉錄因子-κB(NF-κB)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-10(IL-10)和白細胞介素-13(IL-13)基因的mRNA序列，以β-肌動蛋白(β-actin)基因作為內參基因，用Primer-BLAST設計上述引物(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表3。

表3 引物序列

1.3.6 實時熒光定量PCR

以合成的cDNA為模板，按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明，在實時熒光定量PCR儀上進行，反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環。采用相對定量分析法，以β-actin作為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達量。

1.4 數據處理和統計分析

試驗數據經Excel 2010初步整理后，應用SAS 9.2軟件中的一般線性模型(GLM)程序按試驗設計對數據進行方差分析，以重復為試驗單元，模型的主要效應包括葉酸、維生素B12處理以及二者之間的互作效應。F檢驗顯著差異者，以最小顯著差異(LSD)法比較平均值間的差異顯著性。結果以平均值和均值標準誤(SEM)表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 葉酸和維生素B12對產蛋高峰期京紅蛋雞生產性能的影響

由表4可知，飼糧添加不同水平的葉酸和維生素B12及其互作效應對產蛋高峰期京紅蛋雞的平均日采食量、平均蛋重、料蛋比和產蛋率均無顯著影響(P>0.05)。

表4 葉酸和維生素B12對產蛋高峰期京紅蛋雞生產性能的影響

2.2 葉酸和維生素B12對產蛋高峰期京紅蛋雞蛋品質的影響

由表5可知，飼糧添加葉酸對產蛋高峰期京紅蛋雞蛋形指數、蛋殼厚度、哈氏單位和蛋殼比率有顯著影響(P<0.05)，飼糧添加維生素B12對蛋殼厚度和哈氏單位有顯著影響(P<0.05)。葉酸和維生素B12的互作效應除對哈氏單位有顯著影響(P<0.05)外，對其余指標均無顯著影響(P>0.05)。各葉酸或維生素B12添加組(Ⅱ～Ⅸ組)哈氏單位均顯著高于未添加組(Ⅰ組)(P<0.05)，且以Ⅴ組(添加2 mg/kg葉酸+25 μg/kg維生素B12)最高。

表5 葉酸和維生素B12對產蛋高峰期京紅蛋雞蛋品質的影響

2.3 葉酸和維生素B12對產蛋高峰期京紅蛋雞小腸組織形態的影響

由表6可知，飼糧添加葉酸對產蛋高峰期京紅蛋雞空腸和回腸絨毛高度和V/C值均有顯著影響(P<0.05)，飼糧添加維生素B12對十二指腸和回腸絨毛高度和V/C值有顯著影響(P<0.05)，葉酸和維生素B12的互作效應對十二指腸和空腸絨毛高度和V/C值有顯著影響(P<0.05)。Ⅱ組、Ⅳ組、Ⅴ組和Ⅷ組十二指腸絨毛高度顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，Ⅴ組十二指腸V/C值顯著高于Ⅰ組和Ⅶ組(P<0.05)；Ⅴ組空腸絨毛高度和V/C值顯著高于Ⅰ組和Ⅱ組(P<0.05)。結果表明，Ⅴ組蛋雞小腸組織形態得到改善，小腸吸收能力得以增強。

表6 葉酸和維生素B12對產蛋高峰期京紅蛋雞小腸組織形態的影響

2.4 葉酸和維生素B12對產蛋高峰期京紅蛋雞小腸屏障功能相關基因表達的影響

由表7可知，飼糧添加葉酸、維生素B12及其互作效應能顯著提高產蛋高峰期京紅蛋雞十二指腸occludin、claudin-1、ZO-1和MUC2 mRNA相對表達量(P<0.05)。Ⅴ組十二指腸occludin、ZO-1 mRNA相對表達量均顯著高于Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅶ組和Ⅸ組(P<0.05)，Ⅵ組十二指腸claudin-1 mRNA相對表達量顯著高于除Ⅴ組外的其他組(P<0.05)，Ⅴ組十二指腸MUC2 mRNA相對表達量顯著高于除Ⅵ組外的其他組(P<0.05)，Ⅷ組十二指腸MUC2 mRNA相對表達量顯著高于Ⅰ組(P<0.05)。

表7 葉酸和維生素B12對產蛋高峰期京紅蛋雞小腸屏障功能相關基因表達的影響

飼糧添加葉酸對空腸occludin、claudin-1和MUC2 mRNA相對表達量有顯著影響(P<0.05)，對ZO-1 mRNA相對表達量無顯著影響(P>0.05)；飼糧添加維生素B12僅對空腸MUC2 mRNA相對表達量有顯著影響(P<0.05)；葉酸和維生素B12的互作效應對空腸occludin、ZO-1和MUC2 mRNA相對表達量有顯著影響(P<0.05)。Ⅴ組空腸occludin mRNA相對表達量顯著高于Ⅰ組和Ⅸ組(P<0.05)，Ⅲ組空腸ZO-1 mRNA相對表達量顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，Ⅴ組空腸MUC2 mRNA相對表達量顯著高于其他組(P<0.05)。

飼糧添加葉酸僅對回腸occludin mRNA相對表達量有顯著影響(P<0.05)；飼糧添加維生素B12對回腸occludin和MUC2 mRNA相對表達量有顯著影響(P<0.05)；葉酸和維生素B12的互作效應對回腸occludin和MUC2 mRNA相對表達量有顯著影響(P<0.05)。Ⅴ組和Ⅵ組回腸occludin mRNA相對表達量顯著高于其他各組(P<0.05)，Ⅵ組回腸MUC2 mRNA相對表達量顯著高于Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組和Ⅸ組(P<0.05)。

2.5 葉酸和維生素B12對產蛋高峰期京紅蛋雞小腸炎癥相關基因表達的影響

由表8可知，除飼糧添加維生素B12對產蛋高峰期京紅蛋雞十二指腸IL-13 mRNA相對表達量無顯著影響(P>0.05)外，飼糧添加葉酸和維生素B12對十二指腸炎癥相關基因表達均有顯著影響(P<0.05)；葉酸和維生素B12的互作效應對十二指腸TLR4、NF-κB、IL-1β和IL-10 mRNA相對表達量有顯著影響(P<0.05)。除Ⅱ組十二指腸NF-κBmRNA相對表達量與Ⅰ組無顯著差異(P>0.05)外，Ⅱ～Ⅸ組十二指腸TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-1βmRNA相對表達量均顯著低于Ⅰ組(P<0.05)，Ⅱ組、Ⅴ組和Ⅵ組十二指腸IL-10 mRNA相對表達量顯著高于Ⅰ組(P<0.05)。

表8 葉酸和維生素B12對產蛋高峰期京紅蛋雞小腸炎癥相關基因表達的影響

除飼糧添加維生素B12對空腸IL-1βmRNA相對表達量無顯著影響(P>0.05)外，飼糧添加葉酸和維生素B12對空腸炎癥相關基因表達均有顯著影響(P<0.05)；葉酸和維生素B12的互作效應對空腸TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β和IL-10 mRNA相對表達量均有顯著影響(P<0.05)。Ⅴ組空腸TLR4 mRNA相對表達量顯著低于Ⅸ組(P<0.05)，Ⅱ～Ⅸ組空腸NF-κBmRNA相對表達量顯著低于Ⅰ組(P<0.05)，Ⅰ組和Ⅲ組空腸TNF-αmRNA相對表達量顯著高于Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組和Ⅶ組(P<0.05)，除Ⅲ組外，其他各添加組空腸IL-1βmRNA相對表達量均顯著低于Ⅰ組(P<0.05)，Ⅴ組空腸IL-10 mRNA相對表達量顯著高于其他各組(P<0.05)。

飼糧添加葉酸除對回腸IL-1β和IL-10 mRNA相對表達量無顯著影響(P>0.05)外，對其他指標均有顯著影響(P<0.05)；飼糧添加維生素B12對回腸TLR4、TNF-α、IL-10和IL-13 mRNA相對表達量均有顯著影響(P<0.05)；葉酸和維生素B12的互作效應對回腸TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-13 mRNA相對表達量均無顯著影響(P<0.05)。

3 討 論

3.1 葉酸和維生素B12對產蛋高峰期京紅蛋雞生產性能的影響

葉酸是水溶性B族維生素，維生素B12作為一碳代謝的輔酶，兩者都可以做為氨基酸互變中一碳集團的載體參與蛋白質的生物合成，對生命早期的生長發育非常重要[7]。雛雞缺乏葉酸會出現生長不良，羽毛生長凌亂、色澤不佳，貧血及骨粗短癥以及免疫功能低下等癥狀；缺乏維生素B12則可能表現為厭食、生長不良和貧血等。李軼偉等[8]研究表明，肉雞基礎飼糧中添加葉酸可顯著提高其平均日增重，且以3 mg/kg葉酸添加組效果最好。薛安永等[9]研究表明，飼糧添加1.64 mg/kg葉酸能顯著提高8周齡肉雞平均日采食量和平均日增重。Jing等[10]研究表明，在小麥-豆粕型飼糧中添加4 mg/kg葉酸飼喂24周齡蛋雞8周顯著提高了其蛋重和日產蛋重。Bagheri等[11]研究表明，飼糧添加葉酸能夠顯著提高52～58周齡蛋雞的產蛋率和平均蛋重。但也有研究表明，飼糧添加葉酸對蛋雞的生產性能無顯著影響[12-17]，這與本試驗研究結果一致。

3.2 葉酸和維生素B12對產蛋高峰期京紅蛋雞蛋品質的影響

評價蛋品質的常規指標包括蛋形指數、蛋殼強度、蛋殼厚度、蛋黃顏色、哈氏單位和蛋白高度等。葉酸以四氫葉酸形式參與蛋氨酸、組氨酸及絲氨酸等氨基酸代謝，維生素B12可使葉酸轉變為四氫葉酸，從而提高葉酸的利用率[18]。而蛋氨酸又是家禽玉米-豆粕型飼糧中的第一限制性氨基酸，其代謝直接影響蛋雞的生產性能及蛋殼質量。El-Husseiny等[19]研究表明，葉酸、維生素B12和蛋氨酸的互作效應可顯著增加28～43周齡白羽蛋雞蛋殼比重，但對蛋殼厚度無顯著影響。葉酸和維生素B12的添加可改善33周齡蛋雞的蛋殼強度，其中0.5 mg/kg葉酸+0.01 mg/kg維生素B12組蛋殼強度最大為4.2 kg/cm2，比對照組提高了17.32%[20]。本試驗中，飼糧添加葉酸顯著提高了蛋雞的蛋形指數和蛋殼厚度；葉酸和維生素B12互作效應顯著提高了雞蛋哈氏單位，且當添加2 mg/kg葉酸和25 μg/kg維生素B12時，哈氏單位最高。而哈氏單位越高，表明雞蛋蛋白品質越好，這也說明飼糧添加葉酸和維生素B12后，雞蛋哈氏單位得到了改善。

3.3 葉酸和維生素B12對產蛋高峰期京紅蛋雞小腸組織形態的影響

家禽葉酸的主要吸收位點是十二指腸和空腸。腸道作為營養物質吸收的主要場所，其健康發育對家禽生長至關重要。腸道絨毛高度、隱窩深度及V/C值能反映腸道健康情況。腸黏膜組織結構的完整性是衡量腸免疫功能的重要指標[21]。絨毛的發育程度不僅反映腸黏膜結構的完整性，而且決定了機體對營養物質的吸收能力。絨毛越長，腸道與營養物質的接觸面積越大，營養物質的吸收就越好[22]；隱窩深度異常加深與增生，可能意味著腸黏膜發生病變[23]，因此V/C值能夠反映腸黏膜形態結構及功能的整體狀況[24]。本試驗結果發現，飼糧添加2 mg/kg葉酸和25 μg/kg維生素B12時，產蛋雞十二指腸和空腸絨毛高度和V/C值均顯著高于未添加組，且料蛋比降低、產蛋率提高，說明添加適量的葉酸和維生素B12可改善腸道黏膜組織形態，促進腸道對營養物質的吸收。

3.4 葉酸和維生素B12對產蛋高峰期京紅蛋雞小腸屏障功能相關基因表達的影響

腸道黏膜屏障功能和結構的完整性對維持家禽腸道健康和生產具有重要的意義。完整的腸道黏膜屏障包括機械屏障、化學屏障、免疫屏障和微生物屏障[25]。機械屏障是由腸黏膜上皮細胞、細胞間緊密連接等結構組成，是腸道屏障中尤為重要的一部分。緊密連接是由若干種特定功能蛋白所組成，其中occludin、claudin-1和ZO-1是3種關鍵的蛋白組分[26]。研究發現，occludin、claudin-1和ZO-1減少會增加腸道通透性，因此在腸道緊密連接屏障中發揮著重要作用[27]。化學屏障主要是指覆蓋在腸上皮細胞的黏液層。黏液層是機體抵御腸道病原微生物入侵的第1道防線，MUC2是由杯狀細胞分泌，是形成小腸黏液層的主要黏蛋白，因此MUC2表達量是作為評價腸道健康狀態的重要指標之一[28]。MUC2構成的凝膠黏液層結構牢固并保持高度穩定性，能夠有效地保護腸上皮細胞和發揮屏障保護作用[29]。葉酸與維生素B12聯合應用的研究常見于醫學報道，而在家禽營養學上的研究基本處于空白。本試驗結果表明，飼糧添加2 mg/kg葉酸和25 μg/kg維生素B12使得產蛋雞十二指腸和空腸occludin和MUC2 mRNA相對表達量顯著提高，這說明飼糧添加2 mg/kg葉酸和25 μg/kg維生素B12可降低家禽腸道通透性，抵制病原微生物入侵，阻止細菌在腸黏膜表面黏附，進而提高十二指腸和空腸對營養物質的吸收率，這與本試驗發現飼糧添加2 mg/kg葉酸和25 μg/kg維生素B12顯著提高十二指腸和空腸絨毛高度和V/C值的結果相一致。因此我們推測葉酸和維生素B12可能通過影響V/C值、腸道緊密連接蛋白以及MUC2表達的方式來維持和改善腸道物理和化學屏障功能，促進腸道對營養物質的消化吸收。

3.5 葉酸和維生素B12對產蛋高峰期京紅蛋雞小腸炎癥相關基因表達的影響

腸道免疫屏障主要由腸道淋巴組織及免疫細胞構成，通過分泌免疫球蛋白、細胞因子和干擾素等維持腸道穩態。硏究發現，TLR4與腸上皮細胞屏障完整性相關。TLR4在腸黏膜炎性疾病中調控炎性發展，并且TLR4的表達水平會上升[30]。TLR4基因表達可影響下游信號通路促炎細胞因子TNF-α和IL-1β的產生。腸道TNF-α、IL-1β能夠引起炎性介質釋放，參與腸道炎性疾病的發展過程。抗炎性細胞因子IL-10和IL-13能夠在體內抑制活化的T細胞產生炎性細胞因子，抑制炎癥反應的發生。葉酸和維生素B12缺乏將導致白細胞數量減少，淋巴細胞功能損害，進而影響體液免疫，造成中性粒細胞殺菌能力下降[31]。高慶[32]研究表明，飼糧添加適宜劑量的葉酸可明顯改善機體免疫機能，提高仔豬抗病毒的能力。Abd Allah等[33]研究表明，飼糧添加葉酸可以降低小鼠肝臟炎癥因子NF-κB和IL-1β的表達。本試驗結果表明，飼糧添加2 mg/kg葉酸和25 μg/kg維生素B12顯著降低十二指腸和空腸TLR4、TNF-α和IL-1βmRNA相對表達量，顯著降低下游轉錄因子NF-κBmRNA相對表達量，從而減少了腸道炎性疾病的發生，說明飼糧添加2 mg/kg葉酸和25 μg/kg維生素B12對該段腸道健康有正向調節作用。但在回腸中，葉酸和維生素B12互作效應對TNF-α和IL-1βmRNA相對表達量未產生顯著影響，說明葉酸和維生素B12互作效應在不同腸道間存在一定的差異性。這可能與葉酸在十二指腸和空腸中吸收有關。本試驗同時發現，飼糧添加2 mg/kg葉酸和25 μg/kg維生素B12能夠提高十二指腸和空腸IL-10 mRNA相對表達量，說明葉酸和維生素B12互作可以通過增強體液免疫，維護腸道健康。

4 結 論

飼糧添加適宜水平的葉酸和維生素B12可提高產蛋高峰期京紅蛋雞雞蛋的哈氏單位，改善十二指腸和空腸的組織形態，上調十二指腸和空腸occludin、ZO-1、MUC2和IL-10 mRNA的表達，下調十二指腸和空腸NF-κB、TLR4及其下游信號通路TNF-α和IL-1βmRNA的表達，進而增強腸道免疫功能。本試驗中，以飼糧(含1.35 mg/kg葉酸和25 μg/kg維生素B12)添加2 mg/kg葉酸和25 μg/kg維生素B12效果較好。