金華豬和長白豬腸道產丁酸菌相對豐度與丁酸代謝的相關性分析

趙廣民 劉秀婷 代 兵 楊 華 呂文濤 王遠霞 肖英平*

(1.浙江農林大學動物科學學院，杭州 311300；2.浙江農業科學院省部共建農產品質量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室，杭州 310021；3.浙江農業科學院農產品質量安全與營養研究所，杭州 310021)

產丁酸菌是一類能夠發酵碳水化合物、主要代謝產物為丁酸的細菌統稱[1]。常見產丁酸菌主要包括：丁酸弧菌屬(Anaerostipes)、布勞特氏菌屬(Blautia)、丁酸球菌屬(Butyricicoccus)、丁酸單胞菌屬(Butyricimonas)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、顫螺旋菌屬(Oscillospira)、羅斯伯里氏菌屬(Roseburia)、真桿菌屬([Eubacterium]halliigroup)等[1-4]，其主要通過丁酸激酶途徑和丁酰-CoA：乙酰-CoA轉移酶途徑生成丁酸。腸道產丁酸菌作為益生菌對人和動物的生理機能均具有重要意義，其分解未被消化的膳食纖維產生丁酸是結腸細胞能量的主要來源，并對腸黏膜修復及結腸炎和結腸癌的預防起重要作用[2]，有些產丁酸菌可通過本身的結構和免疫特性發揮抗炎癥作用[5]，其數量和多樣性的變化還能預測機體的健康狀況[6]。在經濟動物方面，丁酸能夠提高動物的免疫功能、促進動物生長，并且可通過調節脂肪沉積從而影響肉品質，因此，腸道產丁酸菌與其代謝產物丁酸是調控動物經濟性狀的重要研究靶點[7]。

金華豬是我國優良地方豬種，具有肉質好、繁殖率高、脂肪沉積能力強等優良特性；長白豬原產于丹麥，具有生長速度快、飼料利用率高、瘦肉率高等特點，這2個品種豬是研究肉品質與腸道微生物之間關系的重要模型[8-9]。通過采集糞便分析發現，金華豬腸道優勢菌屬主要包括：乳酸桿菌屬、鏈球菌屬、梭菌屬、SMB53、雙歧桿菌屬、顫螺旋菌屬、糞球菌屬等[10]，而長白豬腸道優勢菌屬主要包括：梭菌屬、SMB53、鏈球菌屬、普氏菌屬、乳酸桿菌屬、Turicibacter、瘤胃球菌屬等[11]。本課題組前期將金華豬和長白豬飼養于相同環境中，并飼喂相同飼糧，對其腸道菌群結構進行分析發現，金華豬和長白豬腸道中菌群結構存在較大的差異，特別是在小腸段中[12]。將金華豬和長白豬腸道微生物移植于抗生素處理小鼠，小鼠可以在一定程度上重現豬的體脂體征，且小鼠腸道內容物中短鏈脂肪酸含量變化也與供體豬相一致，說明了豬腸道微生物可通過產短鏈脂肪酸干預豬的體脂代謝[9]。丁酸作為具有多種生物學功能的短鏈脂肪酸之一，其調節脂肪代謝功能在人[13-14]、小鼠[15]和雞[7]試驗中均已得到證實，但在與豬體脂代謝方面的研究較少，特別是對于豬不同品種和不同腸段中產丁酸菌、產丁酸關鍵功能基因相對表達量和丁酸含量相關性研究。因此，本研究旨在將肥胖型金華豬和瘦肉型長白豬作為研究對象，分析不同脂肪沉積能力豬各腸段主要產丁酸菌、丁酸關鍵功能基因相對表達量以及丁酸含量的差異，揭示豬腸道丁酸代謝與體脂沉積的相關性，為豬腸道微生物丁酸代謝研究和脂肪沉積調控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

分別選擇金華豬和長白豬仔豬各18頭，公母各占1/2，飼養于相同環境中，飼喂相同的飼糧，飼糧組成及營養水平見表1，自由飲水和采食。在240日齡階段，從每個品種中選擇體重相近的公、母豬各5頭屠宰取樣，其中金華豬體重(70.6±9.4) kg，背膘厚(2.71±0.45) cm，長白豬體重(124.5±5.1) kg，背膘厚(1.72±0.16) cm[12]，分別收集十二指腸、空腸、回腸、盲腸和結腸內容物于液氮中速凍后-80 ℃保存。

表1 飼糧組成及營養水平(干物質基礎)

1.2 DNA提取和功能基因相對表達量的實時熒光定量PCR分析

采用QIAamp DNA Stool Mini試劑盒(QIAGEN)提取各腸段內容物微生物基因組DNA。參照Xu等[16]的引物序列對金華豬和長白豬各腸段丁酰-CoA：乙酰-CoA轉移酶(上游引物5′-AAGGATCTCGGIRTICAYWSIGARATG-3′；下游引物5′-GAGGTCGTCICKRAAITYIGGRTGNGC-3′)和丁酸激酶(上游引物5′-TGCTGTWGTTGGWAGAGGYGGA-3′；下游引物5′-GCAACIGCYTTTTGATTTAATGCATGG-3′)基因相對表達量進行實時熒光定量PCR分析。實時熒光定量PCR在ABI 7500型定量PCR儀中進行。體系為10 μL，其中包含了5.0 μL SYBRTMGreen qPCR mix，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 4.0 μL。程序為：95 ℃，2 min預變性；95 ℃，15 s；58 ℃，45 s；72 ℃，1 min；共35個循環。每個樣品做3個重復，最終依據測得的Ct值與標準曲線比較計算樣品中DNA拷貝數(基因相對表達量)。

1.3 高通量測序和生物信息分析

對細菌16S-rRNA基因的V4高變區進行擴增，引物序列如下：515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，在Illumina HiSeq 2500上測序。通過QIIME平臺在97%相似性水平上對操作分類單元(OTUs)進行分類。使用Sliva數據庫對所有OTUs的代表性序列進行物種匹配，根據最終的有效數據(effective Tags)統計各個樣本中各分類水平相對豐度。

1.4 丁酸含量測定

參照Xiao等[11]的方法，準備1.5 mL離心管，將0.1 g左右各腸段內容物樣品，置于管中并加入9倍體積(mL)的超純水，充分振蕩混勻后，12 000 r/min離心10 min，離心后取上清液0.5 mL置于1.5 mL離心管中，隨后加入0.1 mL的25%(w/v)偏磷酸與巴豆酸(內標)混合溶液，在-20 ℃環境下保存過夜。上樣前使用0.22 μm濾膜進行過濾，采用12 000 r/min離心10 min的方式對濾液進行處理，離心處理后取500 μL上清液于氣相色譜儀上進行測定，色譜柱采用毛細管色譜柱(InertCap FFAP)。色譜條件設置為：柱溫110 ℃，汽化室溫度180 ℃；采用FID檢測器，檢測溫度180 ℃；載氣為氮氣，壓力為0.06 MPa，氧氣壓力0.05 MPa，氫氣壓力0.05 MPa，靈敏度為10-1，衰減3.0。

1.5 數據分析

采用SPSS 20.0中的非配對t檢驗進行差異顯著性分析，采用Graphpad 8軟件作圖，數據結果以平均值±標準差(means±SD)表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。采用R軟件進行斯皮爾曼相關性分析。

2 結 果

2.1 金華豬和長白豬不同腸段主要產丁酸菌的相對豐度比較

選取9種重要的常見產丁酸菌屬進行分析發現(圖1)，金華豬和長白豬腸道產丁酸菌差異主要體現在小腸段，金華豬空腸、回腸中布勞特氏菌屬、丁酸球菌屬、丁酸單胞菌屬、糞桿菌屬、真桿菌屬相對豐度顯著低于長白豬(P<0.05)；而顫螺旋菌屬和羅斯伯里氏菌屬顯著高于長白豬(P<0.05)。

Anaerostipes：丁酸弧菌屬；Blautia：布勞特氏菌屬；Butyricicoccus：丁酸球菌屬；Butyricimonas：丁酸單胞菌屬；Faecalibacterium：糞桿菌屬；Fusobacterium：梭桿菌屬；Oscillospira：顫螺旋菌屬；Roseburia：羅斯伯里氏菌屬；[Eubacterium] hallii group：真桿菌屬?！?”：P<0.05。下圖同 The same as below。

分別對金華豬和長白豬的9種常見產丁酸菌相對豐度進行相關性分析發現(圖2)，在金華豬中，丁酸弧菌屬、顫螺旋菌屬、糞桿菌屬、布勞特氏菌屬、丁酸球菌屬、羅斯伯里氏菌屬和真桿菌屬相對豐度間呈極顯著正相關(r=0.20～0.84，P<0.01)；在長白豬中，布勞特氏菌屬、丁酸球菌屬、丁酸單胞菌屬、糞桿菌屬和真桿菌屬相對豐度間呈極顯著正相關(r=0.41～0.88，P<0.01)。

圖2 金華豬和長白豬腸道9種主要產丁酸菌屬相對豐度的相關性分析

2.2 金華豬和長白豬各腸段產丁酸關鍵功能基因相對表達量比較

通過實時熒光定量PCR分析發現(圖3)，丁酸激酶和丁酰-CoA：乙酰-CoA轉移酶基因主要在大腸段富集。金華豬回腸段丁酰-CoA：乙酰-CoA轉移酶基因相對表達量顯著低于長白豬(P<0.05)，且金華豬結腸段丁酸激酶和丁酰-CoA：乙酰-CoA轉移酶基因相對表達量顯著低于長白豬(P<0.05)。

圖3 丁酸激酶和丁酰-CoA：乙酰-CoA轉移酶基因相對表達量比較

2.3 金華豬和長白豬各腸段丁酸含量比較

通過對金華豬和長白豬各腸段內容物中丁酸含量進行分析發現(圖4)，盲腸和結腸是丁酸的主要產生部位，在空腸、回腸、結腸中，金華豬丁酸含量均顯著低于長白豬(P<0.05)。

圖4 不同腸段丁酸含量比較

2.4 金華豬和長白豬腸道主要產丁酸菌相對豐度與丁酸含量和產丁酸關鍵功能基因相對表達量的相關性分析

通過對金華豬和長白豬各腸段主要產丁酸菌相對豐度與丁酸含量和產丁酸關鍵基因相對表達量進行相關性分析發現(表2)，金華豬和長白豬腸道丁酸含量均與丁酸弧菌屬、布勞特氏菌屬、顫螺旋菌屬、羅斯伯里氏菌屬相對豐度呈顯著或極顯著正相關(r=0.318 0～0.700 6，P<0.05或P<0.01)；金華豬和長白豬腸道丁酸激酶基因相對表達量均與丁酸弧菌屬、顫螺旋菌屬、羅斯伯里氏菌屬相對豐度呈顯著或極顯著正相關(r=0.318 4～0.659 9，P<0.05或P<0.01)；金華豬和長白豬腸道丁酰-CoA：乙酰-CoA轉移酶基因相對表達量均與顫螺旋菌屬、羅斯伯里氏菌屬相對豐度呈極顯著正相關(r=0.581 3～0.649 0，P<0.01)。

表2 腸道產丁酸菌相對豐度與丁酸含量和產丁酸關鍵功能基因相對表達量的相關性分分析

2.5 金華豬和長白豬腸道微生物產丁酸關鍵功能基因相對表達量與丁酸含量的相關性分析

通過對腸道丁酸含量與丁酸激酶、丁酰-CoA：乙酰-CoA轉移酶基因相對表達量相關性分析發現(圖5)，丁酸激酶、丁酰-CoA：乙酰-CoA轉移酶基因相對表達量與丁酸含量呈極顯著正相關(r=0.570 4～0.722 1，P<0.01)，2個品種對比發現長白豬相關系數均高于金華豬。

圖5 丁酸激酶和丁酰-CoA：乙酰-CoA轉移酶基因相對表達量與丁酸含量相關性分析

3 討 論

腸道中丁酸是由產丁酸菌在對膳食纖維和未分解的食用碳水化合物、內源蛋白質進行發酵的過程中代謝產生的[17]。本研究發現，金華豬和長白豬腸道產丁酸菌差異主要在小腸段，長白豬空腸、回腸內容物中布勞特氏菌屬、丁酸球菌屬、丁酸單胞菌屬、糞桿菌屬、真桿菌屬相對豐度顯著高于金華豬，長白豬空腸、回腸內容物中顫螺旋菌屬和羅斯伯里氏菌屬相對豐度顯著低于金華豬。通過斯皮爾曼相關性分析發現，顫螺旋菌屬、羅斯伯里氏菌屬相對豐度與其他幾種主要產丁酸菌相對豐度呈顯著負相關。

產丁酸菌生成丁酸主要有2條途徑，即丁酰-CoA：乙酰-CoA轉移酶和丁酸激酶代謝途徑[18]。已有研究表明，單胃動物腸道微生物的產丁酸主要途徑是丁酰-CoA：乙酰-CoA轉移酶途徑，而土壤微生物的主要產丁酸途徑是丁酸激酶途徑[19]。Louis等[20]研究結果認為可以通過丁酰-CoA：乙酰-CoA轉移酶基因和丁酸激酶基因的基因拷貝數來計算產丁酸菌的拷貝數。因此，本試驗通過實時熒光定量PCR分析發現，金華豬結腸段丁酸激酶、丁酰-CoA：乙酰-CoA轉移酶基因相對表達量和丁酸含量均顯著低于長白豬。相關性分析發現，產丁酸菌相對豐度和丁酸含量及產丁酸關鍵基因相對表達量均呈不同程度的正相關關系，丁酸含量和丁酸激酶、丁酰-CoA：乙酰-CoA轉移酶基因相對表達量呈顯著正相關，且長白豬相關系數均高于金華豬。

丁酸作為腸道微生物重要的代謝產物能夠影響宿主基因的表達和參與機體代謝[21]。首先，丁酸可以促進腸道細胞血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4)的合成，ANGPTL4抑制脂蛋白脂肪酶(LPL)活性，使LPL催化血液中乳糜微粒(CM)和極低密度脂蛋白(VLDL)所攜帶的甘油三酯(TG)水解成甘油和脂肪酸受阻，從而阻礙TG沉積到脂肪細胞[22-24]。其次，進入血液通過激活G蛋白耦聯受體(GPCRs)和抑制組蛋白去乙?；?HDAC)調控基因的表達調控多種代謝信號通路，激活GPR41和GPR109A使能量消耗增加、耗氧量增加、瘦素表達增加、TG含量降低[25]。Gao等[26]研究發現，飲食補充丁酸可預防和治療飲食誘導的小鼠胰島素抵抗，其作用機制與促進能量消耗和誘導線粒體功能有關。因此，在本研究中，金華豬體重顯著低于長白豬，背膘后卻顯著高于長白豬[12]，高脂金華豬和低脂長白豬可能與腸道中的丁酸代謝差異有關。

4 結 論

① 金華豬和長白豬主要在小腸段存在腸道產丁酸菌相對豐度差異，金華豬空腸和回腸中產丁酸菌相對豐度顯著低于長白豬，且金華豬結腸段產丁酸關鍵功能基因丁酸激酶和丁酰-CoA：乙酰-CoA轉移酶基因相對表達量顯著低于長白豬，與之相對應的是金華豬空腸、回腸和結腸中丁酸含量顯著低于長白豬。

② 金華豬和長白豬腸道中產丁酸菌與產丁酸關鍵功能基因相對表達量和丁酸含量呈顯著正相關；丁酸激酶和丁酰-CoA：乙酰-CoA轉移酶基因相對表達量也與丁酸含量呈顯著正相關，且長白豬相關系數均高于金華豬，這也在一定程度上解釋了長白豬腸道丁酸含量高于金華豬的原因。