蛋白酶制劑對(duì)蝦醬發(fā)酵過(guò)程中理化性質(zhì)和微生物區(qū)系的影響

李文亞，劉 洋，李 寧，鄭曉衛(wèi)，桑亞新，孫紀(jì)錄,*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司，營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102209）

蝦醬為毛蝦等小型蝦類(lèi)及蝦加工副產(chǎn)物經(jīng)腌制、搗碎、發(fā)酵制成的糊狀食品[1]。蝦醬在東亞和東南亞很流行，是一種傳統(tǒng)調(diào)味品[2-3]。蝦醬味道鮮香，營(yíng)養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、多種維生素及礦物質(zhì)[4-5]。蝦醬的發(fā)酵過(guò)程主要涉及來(lái)自蝦類(lèi)和細(xì)菌的蛋白酶對(duì)原料中蛋白質(zhì)的水解，釋放出氨基酸和肽，從而賦于產(chǎn)品特定的理化性質(zhì)。因此，研究蝦醬在發(fā)酵過(guò)程中的微生物多樣性及其與主要理化性質(zhì)的相關(guān)性，對(duì)了解參與發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)微生物，以改進(jìn)蝦醬生產(chǎn)工藝非常重要[6]。

采取傳統(tǒng)發(fā)酵方法生產(chǎn)蝦醬，發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，蝦醬質(zhì)量不穩(wěn)定。為了改進(jìn)蝦醬生產(chǎn)工藝，縮短發(fā)酵周期，穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量，已經(jīng)開(kāi)始嘗試添加外源蛋白酶制劑。在蝦醬發(fā)酵過(guò)程中加入各種蛋白酶，加速蝦體蛋白質(zhì)的分解轉(zhuǎn)化，縮短發(fā)酵時(shí)間，是加酶發(fā)酵法制備蝦醬的目標(biāo)[1]。謝主蘭等[7]通過(guò)對(duì)蝦醬酶法模擬加工過(guò)程中各工序的細(xì)菌學(xué)分析，得出殺菌工藝條件直接影響蝦醬的風(fēng)味品質(zhì)與細(xì)菌學(xué)品質(zhì)。纂翠華等[4]以小型蜢子蝦為原料，利用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶探究蝦醬酶法發(fā)酵工藝條件，最終確定最佳酶堿性蛋白酶及最佳工藝條件。劉樹(shù)青等[8]通過(guò)外加酶制劑制得了蝦醬，進(jìn)行了工藝研究，考察酶種類(lèi)、用鹽量及溫度對(duì)于蝦醬理化性質(zhì)的影響。在已有研究中，對(duì)蝦醬中加入酶制劑往往只是工藝上的研究，而外加酶制劑對(duì)蝦醬微生物區(qū)系和生物胺的影響尚鮮有報(bào)道。近年來(lái)，基于16S rDNA基因的高通量測(cè)序已被廣泛用于分析食品發(fā)酵體系中的微生物組成[9]。利用高通量測(cè)序分析蝦醬的微生物多樣性可行，而且十分必要。

因此，為了闡明蛋白酶制劑對(duì)蝦醬發(fā)酵過(guò)程中理化性質(zhì)和微生物區(qū)系動(dòng)態(tài)變化的影響，本研究使用高效液相色譜等方法測(cè)定蝦醬的生物胺、氨基酸態(tài)氮、揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）等重要理化指標(biāo)，通過(guò)高通量測(cè)序分析蝦醬的細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)，使用Spearman分析優(yōu)勢(shì)菌群與理化性質(zhì)之間的相關(guān)性。旨在為進(jìn)一步改善蝦醬的酶法輔助發(fā)酵工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦購(gòu)自河北保定市科技市場(chǎng)，品種為蜢子蝦，產(chǎn)地為河北黃驊。

蛋白酶制劑 北京潤(rùn)澤康生物科技公司；硫代巴比妥酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純）福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；丙二醛乙縮醛、生物胺標(biāo)準(zhǔn)品（組胺二鹽酸鹽、酪胺鹽酸、2-苯乙胺、色胺、尸胺二鹽酸鹽、腐胺、精胺、亞精胺）、丹磺酰氯（純度≥99%） 上海源葉生物科技有限公司；E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit 美國(guó)Omega公司；Qubit 2.0 DNA檢測(cè)試劑盒 美國(guó)Life公司；TaqDNA Polymerase 美國(guó)Thermo公司；Agencourt AMPure XP美國(guó)Beckman公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Breeze高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；3-18K型高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；HD-850桌上式潔凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；PHS pH計(jì) 合肥橋斯儀器設(shè)備有限公司；721G可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；XHF-DY高速分散器 山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；Qubit?2.0熒光計(jì) 美國(guó)Invitrogen公司；ABI GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 蝦醬的制作

挑選新鮮蜢子蝦，洗凈瀝水并稱(chēng)質(zhì)量，搗碎攪拌，打漿后放入發(fā)酵罐（每罐200 g），同時(shí)加入蜢子蝦質(zhì)量20%的食鹽，用2 層紗布封口，室溫下自然發(fā)酵（2019年9月20日—10月17日，河北省保定市）。加酶組蝦醬在添加食鹽的同時(shí)加入0.3%中性蛋白酶[10]。

1.3.2 理化指標(biāo)分析

1.3.2.1 pH值測(cè)定

在試管中，將2 g蝦醬和10 mL蒸餾水混合，振蕩2 min，充分混勻，室溫靜置5 min，取出上清液，測(cè)定pH值，每種樣品重復(fù)測(cè)定3 次[11]。

1.3.2.2 TVB-N值的測(cè)定

參照GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》，采用半自動(dòng)凱氏定氮法。

1.3.2.3 丙二醛的測(cè)定

參照GB 5009.181—2016《食品中丙二醛的測(cè)定》，采用分光光度法。

1.3.2.4 氨基酸態(tài)氮的測(cè)定

參照GB/T 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》，采用比色法。

1.3.2.5 生物胺的測(cè)定

采用高效液相色譜法，色譜柱為WondaSil C18（4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相A為0.1 mol/L乙酸銨，流動(dòng)相B為乙腈，柱溫40 ℃，流速1 mL/min，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量20 μL。采用梯度洗脫程序，洗脫程序參照李大偉等[12]的方法。

1.3.3 微生物多樣性分析

1.3.3.1 DNA提取和PCR擴(kuò)增

根據(jù)E.Z.N.A.?Soil DNA Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蝦醬中微生物群落總DNA抽提，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的提取質(zhì)量，使用NanoDrop2000測(cè)定DNA濃度和純度；使用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對(duì)16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min，27 個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），然后72 ℃終延伸10 min，最后在4 ℃進(jìn)行保存。PCR體系：5×TransStart FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物（5 μmol/L）0.8 μL，下游引物（5 μmol/L）0.8 μL，TransStart FastPfuDNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，補(bǔ)足至20 μL。每個(gè)樣本3 個(gè)重復(fù)[13]。

1.3.3.2 Illumina MiSeq測(cè)序和數(shù)據(jù)處理

將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后，使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用Quantus?Fluorometer對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量。使用NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫(kù)，原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)。

使用Trimmomatic軟件對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接。使用的UPARSE軟件（version 7.1），根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行可操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTU）聚類(lèi)并剔除嵌合體。利用RDP classifier對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類(lèi)注釋?zhuān)葘?duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)（SSU128），設(shè)置比對(duì)閾值為70%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Origin 2017處理理化指標(biāo)，結(jié)果用折線圖呈現(xiàn)；利用mothur計(jì)算不同隨機(jī)抽樣下的α多樣性指數(shù)，利用R語(yǔ)言工具制作曲線圖；利用LEfSe進(jìn)行物種差異分析；使用SPSS（Version 22）進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦醬發(fā)酵期間的理化指標(biāo)分析

圖1 蝦醬在發(fā)酵期間的理化指標(biāo)變化Fig.1 Changes in physicochemical properties of shrimp paste during fermentation

由圖1A所示，發(fā)酵期間，兩種蝦醬的pH值均呈波動(dòng)上升趨勢(shì)，可能是由于在微生物的作用下，部分氨基酸、蛋白質(zhì)等被分解為堿性物質(zhì)，如氨、生物胺等[14]；兩種蝦醬的pH值差異不顯著，該結(jié)果與尹超[15]的研究類(lèi)似。SB/T 10525—2009《蝦醬》規(guī)定蝦醬中TVB-N值不得超過(guò)450 mg/100 g[16]。由圖1B可見(jiàn)，在發(fā)酵過(guò)程中，兩種蝦醬的TVB-N值均呈上升趨勢(shì)，加酶組TVB-N值上升較多，但其含量遠(yuǎn)低于限量標(biāo)準(zhǔn)。吳小禾等[11]檢測(cè)成品黃驊蝦醬所測(cè)得TVB-N值最高為401 mg/100 g，遠(yuǎn)高于本研究數(shù)值。由圖1C可以看出，發(fā)酵期間，兩種處理的蝦醬中，丙二醛含量都在逐漸降低。氨基酸態(tài)氮是評(píng)價(jià)魚(yú)露、醬油、蝦醬等產(chǎn)品發(fā)酵程度的首要指標(biāo)。由圖1D可以看出，在發(fā)酵期間，加酶組的氨基酸態(tài)氮含量在7 d后一直高于對(duì)照組，在一定程度上可以縮短蝦醬的發(fā)酵周期。但是，兩組蝦醬中氨基酸態(tài)氮含量差異并不大。這可能是因?yàn)椋被嵩谖r醬中既是外加蛋白酶制劑和微生物產(chǎn)生的蛋白酶分解產(chǎn)物，同時(shí)又是許多微生物可以吸收利用的氮源類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。蝦醬作為一種自然發(fā)酵的產(chǎn)品，其中的微生物區(qū)系復(fù)雜多變，使得發(fā)酵過(guò)程受到許多因素的影響，氨基酸態(tài)氮的積累速度也是如此。為了確保主要的發(fā)酵菌群在蝦醬發(fā)酵過(guò)程中一直處于優(yōu)勢(shì)地位，以穩(wěn)定蝦醬的質(zhì)量穩(wěn)定性，功能微生物的強(qiáng)化發(fā)酵技術(shù)近年來(lái)已開(kāi)始引入蝦醬研究領(lǐng)域。因此，不同的加工方式會(huì)影響蝦醬的理化性質(zhì)。

2.2 蝦醬發(fā)酵期間的生物胺分析

圖2 蝦醬在發(fā)酵期間的生物胺變化Fig.2 Changes in biogenic amine content in shrimp paste during fermentation

對(duì)兩種處理的蝦醬樣品進(jìn)行了8 種生物胺的測(cè)定，分別是色胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、組胺、酪胺、精胺和亞精胺。其中檢測(cè)出的只有色胺和酪胺。由圖2可見(jiàn)，在蝦醬發(fā)酵過(guò)程中，加酶組和對(duì)照組中色胺含量不斷升高，酪胺呈現(xiàn)微小波動(dòng)變化；加酶組和對(duì)照組并無(wú)明顯差異，這說(shuō)明外加蛋白酶制劑并不會(huì)影響蝦醬中生物胺的含量。此外，與安全限量相比，兩種蝦醬中生物胺含量都很低，符合質(zhì)量安全要求。這與兩種蝦醬中產(chǎn)生物胺細(xì)菌屬的相對(duì)豐度較低一致。如，假單胞菌屬（Pseudomonas）能夠產(chǎn)生物胺，其在對(duì)照組和加酶組兩組蝦醬中相對(duì)豐度均比較低。四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）在發(fā)酵食品中較為常見(jiàn)，且與生物胺的產(chǎn)生有關(guān)，但其在本研究中的兩種蝦醬中含量也很低。

2.3 蝦醬中的微生物多樣性分析

2.3.1 蝦醬樣品的α多樣性指數(shù)

表1 蝦醬發(fā)酵過(guò)程中微生物多樣性Table 1 Microbial community diversity indices in shrimp paste during fermentation

在全部蝦醬樣品中共獲得313 864 條有效序列和1 279 個(gè)OTU。如表1所示，對(duì)照組的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)大于加酶組，說(shuō)明對(duì)照組中物種豐富度比較高。估算微生物多樣性的常用指數(shù)為Shannon和Simpson指數(shù)，如表1所示，對(duì)照組的微生物多樣性高于加酶組。對(duì)照組比加酶組蝦醬樣品中的細(xì)菌種類(lèi)豐富。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，對(duì)照組樣品中細(xì)菌的多樣性在后14 d呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)，加酶組樣品在前14 d呈增加趨勢(shì)，而后逐漸減少。每個(gè)樣品的覆蓋率，即抽樣完整性指數(shù)均在0.99以上，表明測(cè)序結(jié)果獲得了足夠可靠的數(shù)據(jù)質(zhì)量[17-18]。

圖3 兩種蝦醬樣品細(xì)菌稀疏曲線和OTU豐度曲線Fig.3 Rarefaction curves and OTU rank curves for bacterial community in shrimp paste samples with different fermentation times

由圖3A可見(jiàn)，基于OTU水平的樣品相似性為97%的稀疏性曲線分析，表明測(cè)序深度符合測(cè)序和分析的要求。上述蝦醬樣品的曲線均未趨于平坦，這表明蝦醬樣品中還有細(xì)菌繼續(xù)生長(zhǎng)的空間，說(shuō)明蝦醬中的細(xì)菌種類(lèi)十分豐富。從圖3B可以看出，對(duì)照組的曲線更長(zhǎng)也更加平滑，這說(shuō)明相較于加酶組，在對(duì)照組中有更加豐富的細(xì)菌種類(lèi)，并且細(xì)菌的種類(lèi)分布也更加均勻。而加酶組無(wú)論是細(xì)菌的豐度，還是菌種分布的均勻度，都相對(duì)較小。這可能是因?yàn)榧尤氲牡鞍酌钢苿?huì)加速分解大分子蛋白質(zhì)，在蝦醬發(fā)酵初期，外加的蛋白酶制劑迅速降解原料中的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致在加酶組中芽孢桿菌屬（Bacillus）相對(duì)豐度明顯增加，成為一種新的優(yōu)勢(shì)菌屬，因而導(dǎo)致加酶組菌種分布均勻度及細(xì)菌豐度相應(yīng)有所下降。

2.3.2 蝦醬細(xì)菌菌群門(mén)水平分布

圖4 蝦醬細(xì)菌組成在門(mén)水平上的分布Fig.4 Bacterial community composition in shrimp paste at the phylum level

兩組蝦醬樣品中共鑒定出29 個(gè)菌門(mén)，由圖4可見(jiàn)，主要為變形菌門(mén)（Proteobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、軟壁菌門(mén)（Tenenricutes）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）和Epsilonbacteraeota。在蝦醬的整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，優(yōu)勢(shì)門(mén)一直為變形菌門(mén)，這與泰國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵蝦醬中優(yōu)勢(shì)門(mén)為厚壁菌門(mén)有所不同[6]，而與連云港蝦醬中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)結(jié)果相似[13]，由此可見(jiàn)，不同地區(qū)的蝦醬微生物區(qū)系有所差異。在發(fā)酵之初（C0），各菌門(mén)依照相對(duì)豐度由高到低為變形菌門(mén)（51.83%）、擬桿菌門(mén)（23.46%）、Epsilonbacteraeota（6.63%）、厚壁菌門(mén)（5.78%）、放線菌門(mén)（5.77%）、軟壁菌門(mén)（4.99%）。在對(duì)照組蝦醬發(fā)酵過(guò)程中，相對(duì)豐度排在前3 位的菌門(mén)依次為變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和軟壁菌門(mén)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)軟壁菌門(mén)的相對(duì)豐度出現(xiàn)了下降。在加酶組中，相對(duì)豐度排在前3 位的菌門(mén)依次為變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)；在發(fā)酵過(guò)程中，擬桿菌門(mén)減少，而厚壁菌門(mén)增加。由此可見(jiàn)，加入中性蛋白酶制劑后，蝦醬中擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度減少而厚壁菌門(mén)增加。變形菌門(mén)是革蘭氏陰性菌的主要類(lèi)群之一，在人體[19]和蝦類(lèi)[20]中廣泛存在。對(duì)渤海等地區(qū)的養(yǎng)殖池塘中的水體研究也發(fā)現(xiàn)變形菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)類(lèi)群[21-23]。本研究中蝦醬的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)是變形菌門(mén)，很有可能與原料蝦有關(guān)。變形菌門(mén)是細(xì)菌中最大的一門(mén)，包括很多病原菌，如大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、幽門(mén)螺桿菌等[24]。因此，變形菌門(mén)對(duì)蝦醬的品質(zhì)影響極大，在蝦醬的發(fā)酵生產(chǎn)和貯存過(guò)程中需嚴(yán)格控制變形菌門(mén)的生長(zhǎng)。

2.3.3 蝦醬細(xì)菌菌群科水平分布

圖5 蝦醬細(xì)菌組成在科水平上的分布Fig.5 Bacterial community composition in shrimp paste at the family level

在蝦醬中共檢出了305 個(gè)菌科，如圖5所示，主要為紅細(xì)菌科（Rhodobacteraceae）、莫拉菌科（Moraxellaceae）、黃桿菌科（Flavobacteriaceae）、桿狀菌科（Bacillaceae）、蟲(chóng)原體科（Entomoplasmatales-Incertae-Sedis）、伯克氏菌科（Burkholderiaceae）、全孢菌科（Holosporaceae）、脫硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）、擬南芥科（Arcobacteraceae）、希瓦氏菌科（Shewanellaceae）和弧菌科（Vibrionaceae）。在發(fā)酵初時(shí)（C0），相對(duì)豐度由高到低為黃桿菌科（18.75%）、弧菌科（13.09%）、希瓦氏菌科（7.07%）、擬南芥科（6.61%）、莫拉菌科（4.85%）。在對(duì)照組發(fā)酵過(guò)程中，前3 位的優(yōu)勢(shì)科是紅細(xì)菌科、黃桿菌科和脫硫弧菌科。與戴玲瑛等[13]研究所得的連云港蝦醬優(yōu)勢(shì)菌科為弧菌科有差異。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，紅細(xì)菌科相對(duì)豐度增加，而黃桿菌科和脫硫弧菌科呈現(xiàn)波動(dòng)變化。在加酶組中，前3 位的優(yōu)勢(shì)科是紅細(xì)菌科、莫拉菌科和桿狀菌科；在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，紅細(xì)菌科和桿狀菌科均有所增加，而莫拉菌科呈現(xiàn)減少趨勢(shì)。因此，加入蛋白酶制劑后，蝦醬中莫拉菌科、桿狀菌科和全孢菌科增加，而黃桿菌科和脫硫弧菌科減少。

2.3.4 蝦醬細(xì)菌菌群屬水平分布

圖6 蝦醬細(xì)菌組成在屬水平上的分布Fig.6 Bacterial community composition in shrimp paste at the genus level

本研究中共得到了642 個(gè)菌屬，如圖6所示，主要為黃桿菌屬（Flavobacterium）、芽孢桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、Candidatus-Hepatoplasma、副球菌屬（Paracoccus）、弓形桿菌屬（Arcobacter）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）和弧菌屬（Vibrio）。在蝦醬發(fā)酵的初始階段（C0），相對(duì)豐度由高到低為黃桿菌屬（17.78%）、弧菌屬（13.05%）、希瓦氏菌屬（7.07%）。這與尹超[15]研究結(jié)果中發(fā)酵初始階段優(yōu)勢(shì)菌屬為中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、苯基桿菌屬（Phenylobacterium）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）和鹽漬微菌屬（Salimicrobium）有所不同，這可能是因?yàn)樵袭a(chǎn)地和發(fā)酵方式的不同。在對(duì)照組發(fā)酵過(guò)程中，前3 位的優(yōu)勢(shì)菌屬為黃桿菌屬、Candidatus-Hepatoplasma和副球菌屬。Jung等[25]發(fā)現(xiàn)，在15℃條件下，含25 g/100 mL食鹽發(fā)酵的蝦制品中優(yōu)勢(shì)菌屬為鹽厭氧菌屬（Halanaerobium）。Lee等[26]證明，在15 ℃發(fā)酵時(shí)，鹽沼蝦中最終加鹽量為20 g/100 mL和24 g/100 mL的蝦醬中優(yōu)勢(shì)菌屬均為鹽厭氧菌屬，而在28 g/100 mL加鹽量的樣本中，鹽漬微菌最終成為占主導(dǎo)地位的菌屬。Lee等[27]研究顯示，在25 g/100 mL鹽漬蝦樣品中，鹽漬微菌在10 ℃發(fā)酵時(shí)未出現(xiàn)，但在20 ℃和25 ℃發(fā)酵時(shí)為優(yōu)勢(shì)菌屬。本結(jié)果與之前研究的蝦制品中優(yōu)勢(shì)菌屬存在差異，這說(shuō)明原料及制作方式會(huì)對(duì)蝦制品微生物區(qū)系產(chǎn)生影響[28-29]。黃桿菌屬在發(fā)酵過(guò)程中出現(xiàn)緩慢下降，由最初的17.78%減少至10.45%，但是其在整個(gè)過(guò)程中都被檢測(cè)到，說(shuō)明它可能是發(fā)酵過(guò)程中主要的微生物，但在泰國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵蝦醬中并未檢測(cè)出[6]。芽孢桿菌屬由最初的0.06%緩慢減少至0.01%，不動(dòng)桿菌屬也出現(xiàn)了輕微增長(zhǎng)，Candidatus-Hepatoplasma在發(fā)酵過(guò)程中相對(duì)豐度增加。在加酶組發(fā)酵過(guò)程中，排名前3的優(yōu)勢(shì)菌屬為芽孢桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬和嗜冷桿菌屬。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，芽孢桿菌屬相對(duì)豐度增加。在加入蛋白酶制劑后黃桿菌屬相對(duì)豐度降低，至發(fā)酵末期，所占比例為2.75%，與對(duì)照組明顯不同的是，芽孢桿菌屬含量顯著增加，在發(fā)酵末期所占比例為20.69%。芽孢桿菌屬為產(chǎn)乳酸菌屬，所以在整個(gè)發(fā)酵中加酶組的pH值低于對(duì)照組。不動(dòng)桿菌屬較對(duì)照組也有所增加，而Candidatus-Hepatoplasma在發(fā)酵結(jié)束時(shí)相對(duì)豐度降低至1.6%。弧菌屬在蝦腸道中普遍存在[30-31]，對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道和三疣梭子蟹腸道進(jìn)行多樣性分析后也可得出相同的結(jié)論[32-33]。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中四聯(lián)球菌屬相對(duì)豐度較低，四聯(lián)球菌屬在高滲發(fā)酵食品中較為常見(jiàn)[34]，但在本研究結(jié)果中豐度較低，這在Kobayashi等[35]研究中已有報(bào)道。

通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）可以看出，加酶組和對(duì)照組均分別聚集，表現(xiàn)出與C0樣品明顯的組成成分差異，表明對(duì)照組中蝦醬樣品細(xì)菌組成的相似性。其余樣品中E7、E14、E21形成聚集，表明加酶組樣品中類(lèi)似的細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)。圖7表明，對(duì)照組和加酶組樣品之間存在顯著差異（P＜0.05），說(shuō)明加入蛋白酶制劑后對(duì)蝦醬的微生物區(qū)系影響顯著。

圖7 蝦醬發(fā)酵不同時(shí)期的PCAFig.7 Principal composition analysis plot for discrimination of shrimp paste samples with different fermentation times

2.3.5 不同處理蝦醬差異菌群分析

使用線性判別分析（LEfSe）找出對(duì)組間差異存在顯著影響的微生物類(lèi)群，如圖8所示，擬桿菌門(mén)、擬桿菌綱（Bacteroidia）、黃桿菌目（Flavobacteriales）、黃桿菌屬、Deltaproteobacteria、脫硫弧菌目（Desulfovibrionales）等在對(duì)照組中相對(duì)豐度顯著高。桿狀菌科、芽孢桿菌屬、厚壁菌門(mén)、Holosporales、Alfhaproteobacteria等在加酶組中相對(duì)豐度顯著高，對(duì)菌群組間差異存在顯著影響。值得注意的是，在加酶組蝦醬中檢測(cè)到高豐度的芽孢桿菌屬，這可能引起加酶組蝦醬品質(zhì)下降。

圖8 蝦醬微生物群落結(jié)果直方圖（閾值為4）Fig.8 Histogram of the microbiota of shrimp paste with a threshold value of 4

圖9 蝦醬在屬水平組間差異菌群圖Fig.9 Differential bacterial genera between the two types of shrimp paste

圖9 是在屬水平上探索影響較大的差異菌群，其中芽孢桿菌屬、乳球菌屬在組間差異為顯著。證明加入蛋白酶制劑后，芽孢桿菌屬顯著增加，而乳球菌屬顯著減少。芽孢桿菌屬在海洋環(huán)境中大量分布[36]，通常情況下，添加淀粉質(zhì)原料于發(fā)酵性魚(yú)蝦產(chǎn)品中，會(huì)提高芽孢桿菌屬的相對(duì)豐度，本研究中，添加商品化中性蛋白酶后芽孢桿菌屬相對(duì)豐度增加，成為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，與前者結(jié)果一致。由于兩種處理下的蝦醬原料相同，故排除原料對(duì)微生物區(qū)系的影響后可以得出，添加商品化酶制劑會(huì)顯著增加芽孢桿菌屬的含量[37]。此外，本研究添加酶制劑后希瓦氏菌屬相對(duì)豐度增加，希瓦氏菌屬往往會(huì)引起水產(chǎn)品腐敗及組胺的積累，所以在安全方面對(duì)于加酶蝦醬應(yīng)更為重視。

2.4 細(xì)菌菌群與理化性質(zhì)之間的相關(guān)性

2.4.1 主要優(yōu)勢(shì)菌群與理化性質(zhì)的相關(guān)性分析

為了對(duì)細(xì)菌菌群與理化性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析，通過(guò)Spearman分析構(gòu)建了理化性質(zhì)與主要菌屬之間的相關(guān)性熱圖。由圖10可知，與弓形桿菌屬有較高相關(guān)性的為T(mén)VB-N值，該菌屬與TVB-N值呈顯著負(fù)相關(guān)（R2=-0.79），與丙二醛含量呈正相關(guān)（R2=0.75）。芽孢桿菌屬與TVB-N值呈正相關(guān)（R2=0.64），這說(shuō)明芽孢桿菌屬可能是導(dǎo)致加酶組蝦醬品質(zhì)下降的原因。黃桿菌屬與丙二醛含量呈正相關(guān)（R2=0.96），與TVB-N值和氨基酸態(tài)氮含量呈負(fù)相關(guān)，對(duì)于黃桿菌屬在蝦醬發(fā)酵中的作用還尚未可知，需要以后多加研究。副球菌屬和pH值、氨基酸態(tài)氮含量和色胺含量呈正相關(guān)。乳球菌屬與TVB-N值呈負(fù)相關(guān)（R2=-0.82），在之后研究中可以考慮通過(guò)添加乳球菌屬提高蝦醬樣品的品質(zhì)。據(jù)目前已有的報(bào)道，乳酸菌是產(chǎn)生生物胺的主要微生物，其中腸球菌、乳桿菌、乳球菌、明串珠菌、片球菌和鏈球菌是生物胺的強(qiáng)力生產(chǎn)者，然而，本研究結(jié)果中生物胺含量與乳球菌屬并沒(méi)有呈現(xiàn)高度相關(guān)性，它也證實(shí)了生物胺的形成高度依賴(lài)于細(xì)菌菌株而不是微生物的種類(lèi)[38]。

圖10 細(xì)菌屬與理化性質(zhì)的相關(guān)分析Fig.10 Correlation analysis between bacterial genera and physicochemical properties

2.4.2 蝦醬樣品理化性質(zhì)與主要物種的冗余分析（redundancy analysis，RDA）

圖11 蝦醬樣品理化性質(zhì)與細(xì)菌屬之間的RDAFig.11 RDA analysis between physicochemical properties and bacterial genera of shrimp paste samples

RDA使用物種水平的OTU數(shù)據(jù)顯示了不同處理蝦醬樣品中微生物群落的差異。由圖11可以看出，添加酶制劑使蝦醬樣品在微生物群落中出現(xiàn)明顯差異。從RDA可以看出3 類(lèi)微生物群落結(jié)構(gòu)，第1組是主要由黃桿菌屬組成的初始發(fā)酵蝦醬樣品C0，第2組是主要由Candidatus-Hepatoplasma和黃桿菌屬組成的對(duì)照組（C7、C14和C21），第3組是主要由芽孢桿菌屬組成的加酶組（E7、E14和E21）。同時(shí)，結(jié)果顯示添加酶制劑后導(dǎo)致TVB-N值高于對(duì)照組，這可能造成蝦醬的品質(zhì)下降。因此，對(duì)于外加蛋白酶制劑所制得的蝦醬，應(yīng)該對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行更為全面的評(píng)價(jià)，以更好地保證蝦醬的質(zhì)量與安全。

3 結(jié) 論

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)分析外加酶制劑對(duì)于蝦醬微生物區(qū)系的影響，對(duì)蝦醬進(jìn)行微生物多樣性分析后共得到29 個(gè)門(mén)、305 個(gè)科、642 個(gè)屬。在門(mén)水平上，所有樣品中變形菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，對(duì)照組中擬桿菌門(mén)豐度較高，而加酶組中厚壁菌門(mén)豐度較高；在科水平上，對(duì)照組中黃桿菌科為優(yōu)勢(shì)菌科（18.75%），加酶組中桿狀菌科為優(yōu)勢(shì)菌科（20.69%）；在屬水平上，對(duì)照組中黃桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，而加酶組中芽孢桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。通過(guò)LEfSe分析得到外加酶制劑使得芽孢桿菌屬和乳球菌屬在兩種處理蝦醬之間產(chǎn)生顯著差異，通過(guò)理化性質(zhì)可以得出，添加中性蛋白酶可能使蝦醬的品質(zhì)有所下降，但對(duì)于生物胺并無(wú)顯著影響。所以，在以后的工業(yè)生產(chǎn)中，要對(duì)不同處理得到的蝦醬進(jìn)行質(zhì)量的嚴(yán)格控制，可以考慮從原料新鮮度、發(fā)酵溫度及添加劑進(jìn)行改進(jìn)，將生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化以降低風(fēng)險(xiǎn)。這對(duì)于保證蝦醬的安全與質(zhì)量具有重要意義。