腐乳丁酸及產丁酸菌發酵特性分析

馬艷莉，段 哲，梁靜靜，李素萍，丁玉峰

（1.南陽理工學院 河南省工業微生物資源與發酵技術重點實驗室，河南 南陽 473004；2.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071000）

腸道微生態健康是近年來備受關注的健康問題，發酵食品對微生態的影響引起世界關注，國際上對發酵食品研究已深入到腸道微生態領域[1-3]。腐乳是大豆經磨漿、成坯、前酵、腌制、后酵等過程制作的傳統發酵豆制品，歷史悠久、風味獨特、營養豐富，其中最具特色的為青方腐乳[4]。青方腐乳又被稱為“臭豆腐”，外觀呈青色，更多呈豆青色，是眾多腐乳種類中最具特色的一類。通常認為，青方腐乳在發酵過程中因部分蛋白質降解，游離出硫氫基和氨基，產生具有硫臭和氨臭等特殊強烈刺激性氣味，因此又被稱為臭腐乳。

短鏈脂肪酸是指碳原子數小于6的有機脂肪酸，近年來，由于發現其在微生態健康方面的重要作用而被廣泛關注[5-7]。丁酸是最重要的短鏈脂肪酸，在調節腸道菌群平衡、維持腸道微生態健康方面發揮積極作用[8]，丁酸還是組蛋白去乙酰化酶的抑制劑，有助于免疫細胞育成，具有抗細胞增生、促進癌細胞凋亡的能力[9]。目前已有多個丁酸的前體藥物被合成和研究[10-11]。因此，在食品范圍內尋找含有丁酸的產品具有重要意義。但是，由于高濃度丁酸具有刺激性臭味，往往被作為破壞食品風味品質的組分，前期研究發現，丁酸是青方腐乳關鍵揮發性風味成分，風味閾值較低，對青方腐乳特征性臭味貢獻較大，在青方腐乳中含量為2.44 μg/g[12]。青方腐乳“聞著臭，吃著香”的獨特風味為部分人所喜愛，甚至是嗜愛，有一定的消費基礎，因此，青方腐乳中高丁酸含量不會引起風味品質下降，青方腐乳有可能成為丁酸的載體，促進丁酸消費，有助于其功能性發揮。

研究表明，多種微生物可以產丁酸，丁酸梭菌（Clostridium butyricum）是最受關注、研究最多的產丁酸微生物[13-14]。1933年，丁酸梭菌最早在日本被發現并報道，目前將其活菌制劑作為整腸劑用于調節腸道微生態平衡已有60多年。作為益生菌，丁酸梭菌在維持腸道菌群平衡、增強免疫力、預防腫瘤發生等方面有很好的功效[15]。

本研究在前期確定丁酸是青方腐乳特征性風味物質[12]，并從青方腐乳中分離鑒定出丁酸梭菌BP01[16]的基礎上，使用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法比較不同類型腐乳丁酸及其他短鏈脂肪酸含量，并研究青方腐乳生產過程中丁酸變化規律，對亨蓋特厭氧滾管法結合分子生物學技術從青方腐乳中分離鑒定的丁酸產生菌部分發酵特性進行分析，研究結果將有利于發現富含丁酸的食品資源，并為丁酸梭菌進一步應用提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青方、紅方、白方、低鹽紅腐乳及不同品牌青方腐乳為市售商品，購自北京某大型超市。所用菌種大腸桿菌（Escherichia coliO78）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus26003）來自中國科學院微生物研究所，蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）為實驗室保藏。

短鏈脂肪酸標準品（色譜純）、酪蛋白 美國Sigma公司；酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉 英國Oxoid公司；乙腈（色譜純） 美國Dima公司。

1.2 儀器與設備

LC-10A HPLC儀、UV mini 1240紫外-分光光度計日本Shimadz公司；HPS-250生化培養箱 哈爾濱市東明醫療儀器廠；A05077厭氧培養罐 重慶江雪科技有限公司；YXQ-SG46-280A蒸汽滅菌器 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；HZQ-F160振蕩培養箱 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；TDL-40B臺式離心機、TGL-16B冷凍離心機 上海安亭有限責任公司；KQ-100E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；WSZ-100A渦旋振蕩器 上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 丁酸及其他短鏈脂肪酸含量測定

采用HPLC法測定樣品中丁酸及其他短鏈脂肪酸的含量，參考Zhang Jianhua等[17]的方法，略有改動。

樣品提取液制備：稱取樣品凍干粉0.50 g于50 mL離心管中，加入40 mL蒸餾水，超聲振蕩30 min，8 000 r/min離心20 min，取上清液，過0.45 μm濾膜制得樣品提取液。

HPLC檢測條件：色譜柱：Shimadzu SCR-101（H）（7.9 mm×300 mm，10 μm）；流動相：5 mmol/L硫酸溶液；柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm。

1.3.2 丁酸產生菌發酵特性測定

1.3.2.1 生長曲線和pH值曲線測定

將丁酸產生菌活化后稀釋到104CFU/mL，取0.1 mL接種到9.9 mL梭菌增殖培養基中，37 ℃厭氧培養，間隔適當時間分別取厭氧管混勻后測其OD600nm和pH值，繪制生長曲線和pH值曲線。

1.3.2.2 不同碳源培養基配制及丁酸產生菌的培養

以葡萄糖為碳源的培養基按照梭菌增殖培養基（RCM培養基）配制：胰蛋白胨10.0 g、酵母浸膏3.0 g、牛肉浸膏10.0 g、葡萄糖5.0 g、三水合乙酸鈉3.0 g、氯化鈉5.0 g、半胱氨酸鹽0.5 g、0.5%美藍0.2 mL、瓊脂15.0 g（固體培養基添加）、蒸餾水1 000 mL，調節pH值為7.0，滅菌20 min備用。

以乳酸為碳源的培養基配制：將梭菌增殖培養基中葡萄糖替換為同樣含量的乳酸；以葡萄糖和乳酸為碳源的培養基配制：將梭菌增殖培養基中葡萄糖減半，使用乳酸替換。將0.1 mL活化后稀釋到104CFU/mL的丁酸產生菌接種到9.9 mL以上3 種培養基中，37 ℃厭氧培養24 h后，按照1.3.1節方法測定其發酵液中丁酸含量。

1.3.2.3 抑菌能力實驗

采用瓊脂擴散法對丁酸產生菌抑菌能力進行測定。以大腸桿菌O78、金黃色葡萄球菌26003和蠟樣芽孢桿菌作為指示菌研究其抑菌能力，每個菌株活化2 次，并將菌懸液濃度調整為107CFU/mL。吸取稀釋后的指示菌菌懸液0.1 mL，涂布在營養瓊脂培養基上并靜置5 min，使用直徑為6 mm的無菌打孔器打孔，吸取50 μL離心后的丁酸產生菌發酵液，分別加入不同孔中，在厭氧條件下培養24 h，觀察是否出現抑菌圈，并記錄包括孔直徑在內的抑菌圈直徑，同時用未接種BP01菌株的RCM培養液作為空白對照。

1.3.2.4 食鹽耐受性實驗

在梭菌增殖培養基中分別添加0、5、8、11 g/100 mL的食鹽，將0.1 mL活化后稀釋到104CFU/mL的丁酸產生菌接種到9.9 mL以上4 種培養基中，37 ℃厭氧培養24 h后，測其OD600nm值，研究其食鹽耐受性。

1.3.2.5 溫度適應性實驗

將0.1 mL活化后稀釋到104CFU/mL的丁酸產生菌接種到9.9 mL梭菌增殖培養基中，分別在20、28、37 ℃和45 ℃厭氧培養24 h后，測其OD600nm值，研究其溫度適應性。

1.4 數據處理及分析

使用SPSS 23.0軟件進行方差分析，Duncan多重檢驗確定數據間的差異，P＜0.05，差異顯著。每個樣品測定3 次，測定其平均值。

2 結果與分析

2.1 青方腐乳丁酸及其他短鏈脂肪酸分析

短鏈脂肪酸是指碳鏈中碳原子數小于6的有機脂肪酸，近年研究發現，短鏈脂肪酸在調節腸道菌群平衡、改善腸道功能、調節免疫、抗腫瘤和調控基因表達等方面發揮積極作用[18]。作為短鏈脂肪酸中最主要的代表，丁酸是結腸黏膜上皮細胞的主要能量來源，在調節腸道微生態平衡方面發揮重要作用，受到廣泛關注[19]。在前期對青方腐乳關鍵揮發性風味物質研究中發現，丁酸是青方腐乳關鍵性風味成分之一，對其特征性風味形成起重要作用，在此基礎上，使用HPLC法測定了同一品牌青方、紅方、白方和低鹽紅腐乳的丁酸含量，結果如圖1所示，青方腐乳丁酸含量明顯高于其他3 種類型腐乳，其含量達到25.4 mg/g（干質量，下同），而紅方、白方和低鹽紅腐乳丁酸含量較低，且三者之間沒有顯著性差異。不同類型腐乳發酵方式最大的區別在于后酵湯料中添加的輔料不同，紅方腐乳誘人的紅色是由于后酵過程中添加了紅曲米，紅方腐乳后酵湯料中還添加面曲、白酒、食鹽、糖、香料等輔料；白方腐乳在生產過程中不添加紅曲米，保持本色，但是添加白酒；低鹽腐乳生產過程中降低了食鹽使用量，添加白酒；青方腐乳與紅方、白方、低鹽腐乳相比后酵湯料不添加白酒，湯料中只含有食鹽、黃漿水和少量花椒，沒有白酒、外源蛋白酶、紅曲和面曲等物質引入，使青方腐乳后酵過程微生物分布與其他3 種腐乳存在較大差異，已有研究表明，丁酸梭菌生長會受到乙醇的抑制，而青方腐乳后酵過程不添加乙醇，這可能帶來青方腐乳后酵過程丁酸梭菌快速增殖，丁酸梭菌代謝產生丁酸，使青方腐乳丁酸含量顯著高于其他類型腐乳。

圖1 不同類型腐乳丁酸含量比較Fig.1 Comparison of butyric acid contents among different types of sufu

進一步對其他3 種品牌青方腐乳丁酸含量進行測定，結果發現所測定的3 種品牌腐乳丁酸含量也較高，均超過15 mg/g，此外，還測定了20多種豆豉和豆醬樣品的丁酸含量，發現它們不含或僅含少量丁酸（數據未給出）。這些結果表明，青方腐乳富含丁酸。丁酸由于在促進腸道微生態平衡、防治結腸炎和大腸癌等疾病方面有積極的作用而備受關注，一些以丁酸為前體的藥物被研究和開發。自然存在的丁酸一般由微生物發酵產生，一些發酵食品，如清國醬[20]、納豆[21]、干酪[22]等含有丁酸，其中，文獻報道干酪丁酸含量為0.13～7.3 mg/g，與之相比，青方腐乳丁酸含量具有優勢。但是，丁酸在高濃度時有不愉快氣味，限制了其在食品中功能性的發揮，而丁酸是青方腐乳特征性風味之一，對青方腐乳“聞著臭，吃著香”的獨特風味起貢獻作用，青方腐乳中高濃度丁酸不會對其風味造成不良影響，可能為丁酸功能性發揮提供一個很好的載體。

圖2 不同類型腐乳其他短鏈脂肪酸含量比較Fig.2 Comparison of contents of other short-chain fatty acids among different types of sufu

對同一品牌的4 種腐乳樣品其他短鏈脂肪酸含量進行測定，結果如圖2所示。青方腐乳乙酸和琥珀酸（丁二酸）含量最高，與其他3 種腐乳有顯著差異，但是青方腐乳乳酸含量最低，有文獻報道，乳酸在丁酸菌的作用下可轉化為丁酸[23]，Bourriaud等[24]也發現乳酸在腸道內主要轉化為丁酸，所以青方腐乳的高丁酸含量可能和丁酸菌有關。白方腐乳乳酸和富馬酸（反丁烯二酸）含量最高，其乳酸含量達12.95 mg/g，約是青方腐乳的68.16 倍。Han Beizhong等[25]研究發現，白方腐乳中乳酸菌落數量較其他類型腐乳高，這可能和白方腐乳的高乳酸含量相關。從短鏈脂肪酸總量看，青方腐乳含量最高，白方腐乳次之，紅方腐乳和低鹽紅腐乳含量較低，這可能與不同類型腐乳生產工藝差異導致其微生物組成不同有關。

2.2 青方腐乳生產過程中丁酸及其他短鏈脂肪酸含量變化

圖3 青方腐乳生產過程中丁酸含量變化Fig.3 Changes in butyrate contents during production process of grey sufu

如圖3所示，白坯丁酸含量較低，僅為0.45 mg/g，接種雅致放射毛霉發酵48 h后，毛坯中丁酸含量明顯增加，約為白坯的5.21 倍，這與文獻報道丁酸一般由微生物發酵產生一致[26]。鹽腌過程導致丁酸含量減少，這可能與食鹽進入坯體引起鹽坯固形物含量增加以及鹽坯水分流失相關。青方腐乳后發酵前期，特別是在后酵前30 d，丁酸含量上升迅速，隨后基本穩定，在后酵第45天達到最大值，約為22.47 mg/g，繼續后發酵過程中，丁酸含量輕微降低。這表明，青方腐乳丁酸主要在后發酵前期產生，前期研究發現其他類型腐乳丁酸含量甚微，結合這一結論推測，不同類型腐乳丁酸含量差異由后發酵中微生物差異引起。

圖4 青方腐乳生產過程中其他短鏈脂肪酸含量變化Fig.4 Changes in contents of other short-chain fatty acids during production process of grey sufu

如圖4所示，在前酵和鹽腌過程中，毛坯短鏈脂肪酸含量最高，鹽坯次之，白坯最低，這與毛坯中微生物數量較多相關，因為通常認為短鏈脂肪酸由微生物代謝產生[27]。從單個短鏈脂肪酸含量看，毛坯中乙酸和乳酸含量最高，與白坯和鹽坯有顯著性差異，毛坯和鹽坯中琥珀酸含量較高，與白坯有顯著性差異，但是毛坯、鹽坯和白坯中富馬酸含量都較低。青方腐乳后發酵過程中，乙酸和琥珀酸含量雖然在發酵中期有輕微波動，但基本呈上升趨勢，在后酵結束時，含量分別達18.56 mg/g和6.21 mg/g。乳酸含量在青方腐乳后酵過程中呈下降趨勢，特別是后酵前30 d下降明顯，導致青方腐乳后酵結束時，乳酸含量甚微，這可能與青方腐乳中乳酸在微生物作用下轉化為丁酸相關。

2.3 丁酸梭菌BP01的部分發酵特性分析

發酵食品中的丁酸大多由細菌產生，能產丁酸的微生物主要包括梭菌屬（Clostriduim）、丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）、丁酸桿菌屬（Butyribacterium）等。前期研究發現青方腐乳丁酸含量顯著高于其他類型腐乳，所以對青方腐乳中丁酸產生菌進行分離，得到1 株高產丁酸菌株，48 h培養液中丁酸濃度為6.48 mmol/L，對菌株命名為BP01，分子生物學鑒定結果為丁酸梭菌[16]。進一步對丁酸梭菌BP01的部分發酵特性進行研究，以期在青方腐乳發酵過程中應用丁酸梭菌BP01，從而為提高青方腐乳丁酸含量提供參考。

圖5 BP01菌株生長曲線和pH值曲線Fig.5 Growth curve of strain BP01 and pH variation in its fermentation broth

如圖5所示，菌株在RCM培養基中4 h左右進入對數生長期，菌落數指數上升，代謝產生酸性物質使培養基pH值快速下降。從培養液菌落數看，BP01在18 h進入對數生長穩定期，pH值穩定在5.8左右，而后在約24 h由于形成芽孢，pH值略有上升。

圖6 碳源對BP01菌株產丁酸的影響Fig.6 Effect of carbon source on butyric acid-producing capacity of strain BP01

分別使用葡萄糖、乳酸、葡萄糖+乳酸作為碳源對BP01菌株進行厭氧培養，菌株均生長良好，對其代謝終產物中的丁酸含量測定，圖6結果表明，BP01菌株可以利用葡萄糖和乳酸作為碳源生長代謝產生丁酸，雖然二者轉化丁酸的效率不同，但是可能因為BP01菌株對兩種碳源利用率有差異，所以葡萄糖和乳酸作為單一碳源的代謝終產物中丁酸累積量沒有顯著差異。葡萄糖和乳酸同時作為碳源時，BP01菌株代謝終產物中丁酸含量明顯增加，是葡萄糖和乳酸單獨作為碳源時的3 倍多，可能是由于丁酸梭菌BP01在葡萄糖作為碳源存在的情況下代謝乳酸產生丁酸的效率提高，而在乳酸存在條件下，丁酸梭菌對葡萄糖的利用率也可以得到提升，二者產生了協同效應，從而提高了BP01菌株代謝終產物中丁酸含量，這與胡小紅等[28]研究有類似之處，胡小紅等[28]從窖泥中分離鑒定丁酸梭菌BEY8，研究發現其能代謝乳酸產生丁酸，乳酸的轉化效率可進行調控。這與本研究有類似之處。這為下一步實驗提供思路，可以嘗試BP01菌株和乳酸菌共培養，利用乳酸菌代謝產生的乳酸提高BP01菌株代謝終產物的丁酸含量，同時添加這兩種腸道微生態健康的益生菌到腐乳中，制作低鹽腐乳，增強其促進腸道健康的功能性。

圖7 BP01菌株的抑菌性Fig.7 Antibacterial activity of strain BP01

傳統發酵豆制品中有時會檢測到某些致病微生物，對產品安全性造成一定隱患，因此，選擇能夠抑制致病菌的有益菌應用于發酵過程中，對保證發酵豆制品的安全性有很大現實意義。BP01菌株對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及蠟樣芽孢桿菌的抑制能力通過測定抑菌圈直徑表示，對照組是未接種BP01菌株的RCM培養液，其抑菌圈直徑為0 mm，說明對照組RCM培養液對3 種致病菌無抑制作用，而由圖7可知，BP01菌株對3 種致病菌具有抑制作用，但抑菌能力有所差異，抑制大腸桿菌能力最強，與其他兩種菌有顯著差異，抑菌圈直徑達12.5 mm。BP01菌株對蠟樣芽孢桿菌抑制能力略強于金黃色葡萄球菌，但二者無顯著差異。文獻報道，丁酸梭菌具有抑制致病菌的能力[29]，與本研究一致。因此，作為一種益生菌，丁酸梭菌具有應用于發酵食品，提高發酵食品微生物安全性的潛力。

圖8 BP01菌株對食鹽的耐受性Fig.8 Salt tolerance of strain BP01

傳統發酵豆制品生產過程中一般會添加一定量食鹽，用于形成特定風味、控制發酵過程、抑制腐敗微生物生長等，因此，考察菌株對食鹽的耐受性對其在發酵豆制品中的潛在應用十分必要。根據腐乳食鹽含量的現狀，設置5、8 g/100 mL和11 g/100 mL 3 個食鹽添加量，考察BP01菌株對食鹽的耐受性，使用OD600nm作為衡量標準。如圖8所示，添加5 g/100 mL和8 g/100 mL食鹽時，BP01菌株生長幾乎不受影響，其OD600nm對照（不添加食鹽）無顯著差異，當食鹽添加量達11 g/100 mL時，BP01菌株的生長受到輕微抑制，其OD600nm相對于對照下降12.34%，但仍可以較好生長，這顯示BP01菌株可以耐受一定量的食鹽，具有應用于含鹽食品的潛力。

發酵溫度會對傳統發酵豆制品品質及功能性產生影響[30-31]，在生產實踐中，一般會依據主要發酵菌種生長特性形成固定的發酵溫度，因此，應對菌株的溫度適應性進行研究，以考察其應用于特定發酵豆制品的潛力。根據腐乳發酵溫度的現狀，設置20、28、37 ℃和45 ℃研究BP01菌株的溫度適應性。如圖9所示，在28 ℃和37 ℃條件下培養，BP01菌株生長良好，OD600nm無顯著性差異，20 ℃和45 ℃條件下，BP01菌株生長略顯緩慢，其OD600nm與37 ℃培養相比，分別降低19.08%和10.53%，但整體上，BP01菌株仍能較好生長，顯示其具有一定的溫度適應性。

圖9 BP01菌株對溫度的適應性Fig.9 Temperature adaptability of strain BP01

3 結 論

本研究在前期確定丁酸是青方腐乳關鍵風味物質的基礎上，分析青方腐乳丁酸及變化規律，進一步研究從青方腐乳中分離鑒定的產丁酸菌的部分發酵特性，得出如下結論：1）青方腐乳富含丁酸，其含量遠高于紅方、白方和低鹽紅腐乳，可作為丁酸潛在的消費載體。2）丁酸主要在青方腐乳后酵前30 d產生，與青方腐乳后酵過程中丁酸梭菌密切相關；青方腐乳乳酸含量較低，并且在后酵過程中呈下降趨勢，可能在特定微生物作用下轉化為丁酸。3）在前期實驗從青方腐乳中分離鑒定丁酸產生菌的基礎上，研究了高產丁酸的丁酸梭菌BP01部分發酵特性，結果表明其培養過程中較快進入對數生長期，在培養18 h后進入生長穩定期，終產物pH值在5.8左右，能利用乳酸作為碳源；BP01菌株抑制大腸桿菌能力最強，對金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌也有抑制作用，能夠耐受一定濃度的食鹽，并表現出一定的溫度適應性，有應用于腐乳發酵潛力。