豆渣可溶酸性多糖的分離純化及結構解析

王思琪，胡彥波，翟麗媛，石曾卉，趙 珺

（長春大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130022）

多糖是一類具有抗氧化、降血糖[1]、降血脂[2]、增強免疫和延緩衰老[3]等功能的高分子化合物，是食品中的主要功能因子之一。水溶性大豆多糖（soluble soybean polysaccharides，SSPS）是一種從大豆種皮、子葉和豆渣中提取的可溶性多糖。研究表明：豆渣的膳食纖維部分主要含有30%的水溶性多糖，是具有潛在價值的巨大資源[4]。從大豆種皮中提取的酸性多糖主要由半乳糖醛酸聚糖（homogalacturonan，HG）和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I（rhamnogalacturonan，RG-I）組成，其化學結構是以鼠李半乳糖醛酸和高聚半乳糖為主鏈、半乳聚糖和阿拉伯糖為側鏈形成的近似球狀體結構[5]。從大豆子葉中提取的酸性多糖主要由D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖醛酸和L-鼠李糖組成。其化學結構是由→4)-α-D-GalpA-(1→4)-α-D-GalpA-單元和→4)-α-D-GalpA-(1→2)-α-L-Rhap-單元構成主鏈的基本骨架，側鏈部分包含β-1,4-Galp和α-1,5-Araf[6]。目前，對于從豆渣中提取的酸性多糖的基本結構特征研究尚不深入，限制了其在食品中的應用。

SSPS是一種酸性多糖，與其他生物多糖相比，其黏度較低，可制成高濃度低黏的水溶液，溶液黏度幾乎不受鹽類影響，對溫度的熱穩定性也優于其他糖類[7-9]。SSPS具有高溶解性、抗氧化性、乳化性和穩定性好等優良特性，可有效改善食品的食用品質、加工特性和外觀特征[10-12]，是一種具有潛在價值的食品添加劑。因此本實驗對豆渣可溶酸性多糖進行分離純化，并對純化后電荷和分子質量均一的部分進行結構解析。研究結果將為豆渣可溶酸性多糖產品的深入研究提供理論依據，使營養成分得以全面開發，同時解決廢棄豆渣所造成的環境污染，為豆渣的開發利用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆渣由榆樹市榆鄉豆制品有限公司提供；苯酚、硫酸（均為分析純） 北京化工廠有限責任公司；DEAE纖維素 上海源葉生物科技有限公司；鼠李糖（rhamnose，Rha）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcA）、甘露糖（mannose，Man）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）、葡萄糖（glucose，Glc）、半乳糖 （galactose，Gal）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）、木糖（xylose，Xyl）、巖藻糖（fucose，Fuc）標準品 國藥集團化學試劑有限公司；乙腈、甲醇、氯化鈉（均為色譜純） 安徽天地高純溶劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-1901紫外-可見分光光度計 億鑫儀器設備有限公司；Nicolet is5傅里葉變換紅外光譜儀 美國賽默飛世爾科技公司；3K15臺式高速離心機、BM312-B旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；LC-20AT高效液相色譜儀（配有CTO-20A泵和SPD-20AVD紫外光檢測器） 日本島津公司；AV 600 MHz核磁共振波譜（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）儀 德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 豆渣多糖的制備

稱取豆渣4 kg，在料液比1∶25（g/mL）、提取時間4 h、加酶量2%、酶解溫度50 ℃條件下提取豆渣。首先調節pH值為4，加入2%的纖維素酶酶解2 h，再加入2%的酸性蛋白酶酶解2 h。用旋轉蒸發儀將多糖溶液濃縮至原體積的1/3，并利用70%乙醇溶液進行過夜醇沉后，4 000 r/min離心20 min棄去上清液得到沉淀，60 ℃水浴不停地攪拌烘干，除去乙醇后，加dH2O溶解，冷凍干燥得到豆渣粗多糖（SSPS）。

1.3.2 豆渣可溶酸性多糖的分離純化

1.3.2.1 豆渣可溶酸性多糖的離子交換色譜

準確稱取豆渣粗多糖（SSPS）粉末2 g，用100 mL的dH2O將其溶解，離心后取上清液緩慢加到DEAECellulose色譜柱中，待樣品完全進入纖維素柱后，用dH2O壓樣2 次，保證樣品完全進入纖維素柱，用dH2O洗去中性糖，再用0～0.5 mol/L NaCl溶液進行梯度洗脫，流速1.5 mL/min，4 min收集一管，用自動收集器收集洗脫液。利用苯酚-硫酸法[13]在波長490 nm處測定收集液的吸光度，繪制洗脫曲線圖，確定豆渣可溶酸性糖梯度洗脫的鹽離子濃度，根據洗脫曲線圖收集電荷均一的對稱峰，透析濃縮后進行冷凍干燥，獲得電荷均一組分。

1.3.2.2 豆渣可溶酸性多糖的凝膠過濾色譜

稱取豆渣酸性多糖SSPS-A1 100 mg，溶于2 mL的dH2O中，離心去除沉淀，然后將上清液上樣于平衡好的Sepharose CL-6B凝膠色譜柱，洗脫液為0.15 mol/L NaCl溶液，流速0.15 mL/min，每管收集液體體積3 mL。利用苯酚-硫酸法[13]測定SSPS-A1洗脫液中的糖含量分布。根據SSPS-A1的糖含量分布曲線，收集合適的洗脫峰，透析濃縮凍干，獲得分子質量均一組分。

1.3.3 豆渣可溶酸性多糖的糖含量、糖醛酸含量和蛋白含量的測定

1.3.3.1 糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法[13]以葡萄糖為標準品；配制不同質量濃度的葡萄糖溶液，在波長490 nm處測定吸光度。以葡萄糖質量濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

樣品中總糖含量的測定：將樣品配制成0.1 mg/mL的多糖溶液，取樣600 μL，加400 μL的dH2O，其余步驟按照標準曲線的操作步驟進行，做3 組平行實驗，在波長490 nm處測定吸光度。根據標準曲線計算樣品中的糖含量。

1.3.3.2 糖醛酸含量的測定

采用間羥基聯苯法[14]以半乳糖醛酸為標準品；配制不同質量濃度的半乳糖醛酸溶液，在波長525 nm處測定吸光度。以半乳糖醛酸質量濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

樣品中糖醛酸含量的測定：將樣品配制成0.1 mg/mL多糖溶液，取樣400 μL，其余步驟按照標準曲線的操作步驟進行，做3 組平行實驗，在波長525 nm處測定吸光度。根據標準曲線計算樣品中的糖醛酸含量。

1.3.3.3 蛋白含量的測定

采用考馬斯亮藍法[15]以牛血清蛋白為標準品；配制不同質量濃度的牛血清蛋白溶液，在波長595 nm處測定吸光度。以牛血清白蛋白質量濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

樣品中蛋白含量的測定：將樣品配制成1 mg/mL多糖溶液，取樣400 μL，其余步驟按照標準曲線的操作步驟進行，做3 組平行實驗，在波長595 nm處測定吸光度。根據標準曲線計算樣品中的蛋白含量。

1.3.4 豆渣可溶酸性多糖的單糖組成分析

稱取1 mg多糖樣品置于酸水解小瓶中，加入1 mL的2 mol/L鹽酸-甲醇溶液，充N2密封后，置于80 ℃金屬浴中水解10 h后用空氣泵吹干，再加入1 mL的2 mol/L三氟乙酸溶液，于120 ℃金屬浴中水解1 h，用空氣泵吹干除去三氟乙酸[16]。稱取100 μL 1 mg/mL的Man、GlcA、Rha、GalA、Glc、Gal、Xyl、Ara和Fuc標準品，得到標準品混合液，置于酸水解小瓶中備用。

向完全酸水解后得到的干燥樣品和標樣中加入500 μL的0.3 mol/L NaOH溶液，使樣品充分溶解，再加入500 μL的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮-甲醇溶液，使其混合，取出200 μL混合液于1.5 mL EP管中。將樣品和標樣在70 ℃條件下水浴反應0.5 h，分別加入100 μL的0.3 mol/L HCl溶液，充分混勻后加入700 μL CH3Cl，充分振蕩后，萃取得到剩余的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮-甲醇試劑，棄去CH3Cl層，保留水層，重復操作萃取3 次。0.22 μm濾膜過濾，然后進行高效液相色譜檢測[17-18]。

高效液相色譜條件：DIKMA Inertsil ODS-3色譜柱（4.6 mm×150 mm）；流動相為磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L、pH 7.0）-乙腈（81∶19，V/V）；流速1.0 mL/min；進樣量20 μL；檢測波長245 nm。

1.3.5 豆渣可溶酸性多糖的分子質量測定

稱取2 mg多糖，溶解于400 μL 0.2 mol/L NaCl溶液中，利用LC-10ATvp高效液相色譜系統，RID-10A示差檢測器及TSK-gel G-3000 PWXL色譜柱測定分離純化后多糖的分子質量分布情況[19]，TSK-gel G-3000 PWXL流速0.6 mL/min，流動相為0.2 mol/L NaCl溶液，柱溫35 ℃。

1.3.6 豆渣可溶酸性多糖均一組分的紅外光譜分析

取干燥的多糖粉末樣品1 mg，與180 mg KBr一起研磨后制成透明壓片，使用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～500 cm-1的波長范圍內進行紅外光譜掃描分析[20]。

1.3.7 豆渣可溶酸性多糖均一組分的核磁分析

稱取待測樣品15 mg，充分溶解于0.5 mL D2O中。采用AV 600 MHz NMR波譜儀檢測樣品的13C NMR譜，檢測頻率為150 MHz[21]。

2 結果與分析

2.1 豆渣可溶酸性多糖的離子交換色譜

圖1 豆渣可溶酸性多糖的梯度洗脫圖Fig.1 Gradient elution curves of acidic polysaccharides from soybean dregs

通過DEAE-Cellulose對豆渣可溶酸性多糖經0～0.5 mol/L NaCl線性梯度進行洗脫，結果如圖1所示。在DEAE-Cellulose離子交換色譜的吸附能力范圍內，不帶電荷的中性多糖組分首先被dH2O洗脫下來，帶電荷的酸性多糖組分隨著NaCl濃度的增加而逐漸被洗脫下來，并在0.19 mol/L和0.34 mol/L的NaCl溶液處有2 個較為明顯的洗脫峰，分別命名為SSPS-A1和SSPS-A2，得率分別為45.5%和10.3%。收集樣品，濃縮透析，凍干。

2.2 豆渣可溶酸性多糖的化學組成和單糖組成分析

如表1所示，SSSP-A1和SSPS-A2的總糖質量分數分別為64.5%和52.6%。糖醛酸質量分數分別為31.1%和24.6%，而蛋白質量分數僅為1.3%和1.2%。對比大豆可溶性多糖提取的相關文獻[10]可知，本次提取的豆渣可溶酸性多糖的蛋白質含量極低，因此本實驗不需要對這2 個組分進行除蛋白處理。同時2 個組分的總糖含量、糖醛酸含量和蛋白含量無顯著差異。進一步對二者的單糖組成進行分析，結果表明組成SSPS-A1和SSPS-A2的單糖存在一定差異。SSPS-A1主要由GalA、Gal和Ara組成，推測SSPS-A1可能由半乳糖醛酸聚糖（HG型）果膠（主要含有GalA）和阿拉伯糖半乳聚糖（AG型）果膠（主要含有Gal和Ara）組成。SSPS-A2主要由GalA、Rha、Gal和Ara組成，推測其可能由HG型果膠和RG-I型果膠（主要含有GalA、Rha、Gal和Ara，其中GalA∶Rha=1∶1）組成。研究表明，大豆中的可溶酸性多糖主要由HG和少量RG-I組成[22]。由于豆渣可溶酸性多糖的GalA含量明顯低于大豆可溶酸性糖[23]，說明酸性多糖可能在大豆產品制備過程中損失，造成酸性多糖產率低。綜合上述結果可知SSPS-A1和SSPS-A2的結構可能存在一定差異。

表1 豆渣可溶酸性多糖的化學組成和單糖組成分析Table 1 Chemical composition and monosaccharide composition of soluble acid polysaccharides from soybean dregs%

2.3 豆渣可溶酸性多糖SSPS-A1的凝膠過濾色譜

圖 2SSPS-A1在Sepharose CL-6B的洗脫結果Fig.2 Elution curve of SSPS-A1 on Sepharose CL-6B column

利用Sepharose CL-6B對SSPS-A1進行分離純化，結果如圖2所示。SSPS-A1在Sepharose CL-6B上主要出現4 個洗脫峰，收集合適的洗脫峰。得到4 個組分SSPSA1-a（得率為8.0%）、SSPS-A1-b（得率為9.0%）、SSPS-A1-c（得率為20.8%）、SSPS-A1-d（得率為8.8%），其中SSPS-A1-c的得率最高。

2.4 豆渣可溶酸性多糖SSPS-A1不同組分的單糖組成分析

進一步通過高效液相色譜測定4 個分子質量組分的單糖組成，結果如表2所示。SSPS-A1-a的主要單糖組分間物質的量比為GalA∶Gal∶Ara=10.8∶38.0∶12.1。SSPS-A1-b的主要單糖組分間物質的量比為GalA∶Gal∶Ara=18.4∶27.7∶21.7。SSPS-A1-c的主要單糖組分間物質的量比為GalA∶Gal∶Ara=17.3∶44.9∶19.1。SSPS-A1-d的主要單糖組分間物質的量比為GalA∶Gal∶Ara=23.9∶26.2∶7.4。從單糖組成結果可知，SSPS-A1四個多糖組分的單糖組成存在一定差異，SSPSA1-a中的Glc略高于其他3 個組分，SSPS-A1-b和SSPSA1-c的組成較為相似，SSPS-A1-d中Ara的含量低于其他3 個組分。

表2 SSPS-A1四個組分的單糖組成Table 2 Monosaccharide compositions of four fractions of SSPS-A1

2.5 豆渣可溶酸性多糖SSPS-A1不同組分的分子質量測定

圖 3SSPS-A1四個組分的高效凝膠滲透色譜洗脫圖Fig.3 HPGPC profiles of four fractions of SSPS-A1

分子質量是多糖結構解析中重要的參數[24]，影響多糖的理化和生物活性等性質[25]。通過對SSPS-A1經凝膠柱色譜分離純化后的多糖利用高效凝膠滲透色譜進行分子質量的測定，使用不同分子質量的葡聚糖作為標準品，得到線性回歸方程為lgmw=0.191 5x+0.952 3，R2=0.998 1，將各個組分的保留時間代入線性回歸方程，可以計算出樣品多糖的分子質量，結果如圖3所示。SSPS-A1-a的分子質量為161.1 kDa、SSPS-A1-b的分子質量為71.7 kDa、SSPS-A1-c的分子質量為31.6 kDa、SSPS-A1-d的分子質量為13.9 kDa。SSPS-A1-c的峰相對狹窄，且相對對稱，說明SSPS-A1-c的分子質量分布相對均一，為SSPS-A1的均一組分。因此，后續將對電荷和分子質量均一的SSPS-A1-c進行結構分析。

2.6 豆渣可溶酸性多糖均一組分的紅外光譜分析

圖 4SSPS-A1-c的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrum of SSPS-A1-c

如圖4所示，參照文獻[26-29]對比可知，在3 422 cm-1附近的吸收峰為多糖O—H伸縮振動特征峰；在2 918 cm-1附近的吸收峰為多糖類物質C—H伸縮振動產生，這是糖類物質的2 個特征吸收峰；在1 724 cm-1附近存在明顯的O—CH3的特征吸收峰，說明SSPS-A1-c存在一定程度的甲酯化或乙酰化修飾。在1 654 cm-1附近的吸收峰顯示為糖醛酸的自由羧基中羥基的彎曲振動峰；說明該物質可能含有糖醛酸；在1 411 cm-1附近顯示為C—H變形振動吸收峰；在1 072 cm-1附近的特征吸收峰表明SSPS-A1-c組分中存在吡喃糖環；實驗結果與單糖組成分析吻合，進一步說明了SSPS-A1-c是含有較多GalpA的酸性多糖。綜合紅外光譜結果可知，SSPS-A1-c具有O—H、C—H和C＝O等酸性多糖的特征吸收峰，同時SSPS-A1-c還存在一定程度甲酯化或乙酰化修飾。

2.7 豆渣可溶酸性多糖中均一組分的NMR

圖 5SSPS-A1-c的13C NMR圖譜Fig.5 13C NMR spectrum of SSPS-A1-c

如圖5所示，t-α-Araf、α-1,5-Araf和t-β-Araf異頭碳信號峰分別出現在δ109.22、δ107.01和δ103.94，為C-1位吸收峰；δ62.94為β-1,3-Galp或t-β-Galp中的C-6位吸收峰[28-29]，說明SSPS-A1-c由主要含有β-Galp和α-Araf的AG型果膠組成[30-32]；此外，從圖5可以看到，α-1,4-GalpA的C-4位和C-2位吸收峰（δ79.14、δ68.79），在δ20.05附近還可以觀察到乙酰基的吸收峰，說明SSPS-A1-c中含有部分乙酰化的HG型果膠。綜合上述核磁結果可推測SSPS-A1-c主要由AG型果膠和HG型果膠結構域組成。

3 結 論

本實驗利用DEAE-Cellulose離子交換柱色譜和Sepharose CL-6B凝膠柱色譜對豆渣可溶性多糖進行分離純化，獲得了一種電荷和分子質量均一的組分SSPSA1-c。進一步對其進行結構分析，結果表明：SSPS-A1-c分子質量為31.6 kDa，主要由半乳糖醛酸（GalA）、半乳糖（Gal）和阿拉伯糖（Ara）組成，其物質的量比為GalA∶Gal∶Ara=17.3∶44.9∶19.1，同時含有少量的鼠李糖（Rha）、葡萄糖（Glc）和木糖（Xyl）。紅外光譜分析表明SSPS-A1-c具有O—H、C—H和C＝O等酸性多糖的特征吸收峰，同時SSPS-A1-c還存在一定程度的甲酯化或乙酰化修飾；核磁共振圖譜表明，SSPS-A1-c主要由AG型果膠和部分乙酰化的HG型果膠組成，其結果與單糖組成和紅外色譜分析結果一致。研究結果將為豆渣可溶酸性多糖的應用提供理論依據，對豆渣的綜合開發利用具有重要意義。