雪蓮菌發酵豇豆工藝優化及其揮發性風味成分分析

王玉瑋 岳田利

(西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 咸陽 712100)

雪蓮菌又稱藏靈菇、西藏雪蓮、開菲爾粒，是一種乳白色或淺黃色的膠質狀顆粒，形狀無規律像蒸熟的米粒，具有彈性及黏稠感[1-2]；富含乳酸菌、乙酸細菌和酵母菌[3]，被認為是一種益生菌資源，這主要是因為除了自身的營養價值外，其代謝產物還能提供各種健康益處，包括抗誘變、抗結腸炎、抗菌和抗氧化等[4]，所發酵的產品也具有獨特的風味。豇豆富含蛋白質、維生素和微量元素，利用乳酸菌發酵的酸豆角，清爽解膩、酸香可口，可以促進人體消化，備受大眾喜愛。因此利用雪蓮菌發酵豇豆，開發風味較好的功能性泡菜具有重要意義。

雪蓮菌發酵的產品風味獨特，如發酵的酸奶有著特有的酸味和香味，并且具有起泡性和醇香味[5]；生產的干酪表面有光澤，不僅具有干酪特有的風味，還具有適宜醇香[6]；發酵面包，面包在貯藏過程中揮發性的香氣能夠保持更加持久[7]。當前，泡菜主要是通過自然發酵或純種乳酸菌發酵產生，發酵過程中微生物代謝貫穿整個代謝過程，其中包含了復雜的物理變化和生物化學反應[8]。研究[9-11][12]20-58發現，發酵條件的不同會影響酸菜的品質和風味特征。張郁松[13]通過單因素和正交試驗確定了接種乳酸菌發酵泡菜的最佳工藝；黃慧福等[14-16]研究發現與自然發酵相比，接種發酵有利于改善泡菜的品質和風味。目前關于雪蓮菌發酵泡菜的研究較少[17]，而關于雪蓮菌發酵蔬菜工藝優化及發酵后泡菜的風味研究尚未見報道。

研究擬利用雪蓮菌發酵豇豆，以感官評分和總酸含量為評價指標，研究鹽添加量、雪蓮菌接種量、發酵溫度、發酵時間對雪蓮菌發酵豇豆品質的影響。在最優發酵工藝下對豇豆進行發酵，并采用高效液相色譜(HPLC)法和氣相色譜—質譜聯用(GC-MS)分析發酵前后風味物質的變化，旨在為開發營養、健康風味良好的功能型泡菜提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雪蓮菌：取自甘南牧民家中，保存于西北農林科技大學健康食品制造與安全控制實驗室；

發酵袋：常德市臨澧縣德特實驗用品經營部；

豇豆、食鹽：市售；

氫氧化鈉：分析純，西安化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

氣相色譜—質譜聯用儀：120150-T230型，日本島津公司；

生化培養箱：ZXDP-B1160型，上海智誠分析儀器制造有限公司；

自動固相微萃取進樣器：50/30 μm PDMS/DVB，美國SUPELCO公司。

1.3 方法

1.3.1 泡菜的制備 將新鮮豇豆除去不可食用部分，再經清洗、瀝干和切分后，稱取200 g裝入1 000 mL的厭氧發酵袋中，加入400 mL鹽水，加入雪蓮菌，密封后放入恒溫培養箱中進行發酵。自然發酵組不接種雪蓮菌。

1.3.2 雪蓮菌的準備 將雪蓮菌從牛奶中濾除，用已滅菌的生理鹽水洗凈備用。

1.3.3 感官評分 根據文獻[12]20，由10人組成的評判小組(5男5女，包括2名專家)，按照泡菜感官評分原則對泡菜的色澤、香氣、滋味和脆性4個方面進行評分。

1.3.4 總酸含量測定 按GB/T 12456—2008執行。

1.3.5 揮發性物質測定 參照Wei等[18]的方法。利用GC-MS自帶軟件，通過與NIST14比對對揮發性化合物進行鑒定，物質濃度用內標進行半定量。

1.3.6 雪蓮菌發酵豇豆單因素試驗

(1) 鹽添加量：固定雪蓮菌接種量1.5%，發酵溫度25 ℃，發酵時間4 d，考察鹽添加量(2%，3%，4%，5%，6%)對豇豆感官評分和總酸含量的影響。

(2) 雪蓮菌接種量：固定鹽添加量4%，發酵溫度25 ℃，發酵時間4 d，考察雪蓮菌接種量(0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%)對豇豆感官評分和總酸含量的影響。

(3) 發酵時間：固定鹽添加量4%，雪蓮菌接種量1.5%，發酵溫度25 ℃，考察發酵時間(2，3，4，5，6 d)對豇豆感官評分和總酸含量的影響。

(4) 發酵溫度：固定鹽添加量4%，雪蓮菌接種量1.5%，發酵時間4 d，考察發酵溫度(15，20，25，30，35 ℃)對豇豆感官評分和總酸含量的影響。

1.3.7 雪蓮菌發酵豇豆正交優化試驗 在單因素的基礎上，以鹽添加量、雪蓮菌接種量、發酵溫度和發酵時間為因素，對豇豆進行感官評分并測定總酸含量，設計L9(34)正交試驗。

1.4 數據處理

試驗結果表示為平均值±標準偏差，采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析和Duncan多重比較(P<0.05)，使用Excel 2019軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 各因素對雪蓮菌豇豆發酵品質的影響

2.1.1 鹽添加量 由圖1可知，隨著鹽添加量的增加，總酸含量下降，是因為發酵過程中乳酸菌活性受到了鹽的抑制，鹽添加量越高對乳酸菌活性的抑制作用越明顯。隨著鹽添加量的增加，感官評分存在顯著性差異(P<0.05)，當鹽添加量為4%時，感官評分最高為91.5分。綜上，選擇鹽添加量為3%，4%，5%為正交試驗中的3個水平。

圖1 鹽添加量對豇豆發酵品質的影響Figure 1 Effect of salt concentration on the fermentation quality of cowpea

2.1.2 雪蓮菌接種量 由圖2可知，隨著雪蓮菌接種量的增加，總酸含量不斷增加；感官評分則先升高后下降，可能是雪蓮菌接種量過低，短時間內沒有形成較適的發酵環境，容易產生污染，影響風味；雪蓮菌接種量過高，發酵速度快致使細胞衰老，出現自溶，影響風味[19]。當雪蓮菌接種量為1.5%時，感官評分最高。故選擇雪蓮菌接種量1.0%，1.5%，2.0% 3個水平進行正交優化試驗。

圖2 雪蓮菌接種量對豇豆發酵品質的影響Figure 2 Effect of inoculation amount of kefir grains on the fermentation quality of cowpea

2.1.3 發酵時間 由圖3可知，隨著發酵時間的延長，總酸含量不斷上升，主要是因為乳酸菌生長代謝所致。隨著酸的積累，泡菜的風味逐漸增強，感官評分也升高，第4天時感官評分最高為82分，總酸含量為3.64 g/kg；但發酵時間過長，酸積累過量會使得豇豆變黏變軟，感官評分下降。尚英等[16]研究發現，接種濕法發酵酸豆角總酸含量為0.35%時達到發酵終點，此時酸豆角品質較高，且酸度符合消費者的口感。因此，選擇發酵時間3，4，5 d進行正交試驗。

圖3 發酵時間對豇豆發酵品質的影響Figure 3 Effect of fermentation days on the fermentation quality of cowpea

2.1.4 發酵溫度 由圖4可知，總酸含量隨發酵溫度的升高而升高；感官評分隨發酵溫度的升高先升高后降低，當發酵溫度為25 ℃時感官評分最高，為85分，總酸含量為3.40 g/kg。從感官評分上看，25 ℃時的感官評分與其他發酵溫度時的差異顯著(P<0.05)，可能是因為發酵溫度較低時，乳酸菌生長代謝均較慢，產酸積累較少，且雜菌容易生長繁殖，最終影響成品的整體風味[20]。綜上，選擇發酵溫度20，25，30 ℃進行正交優化試驗。

圖4 發酵溫度對豇豆發酵品質的影響Figure 4 Effect of fermentation temperature on the fermentation quality of cowpea

2.2 雪蓮菌發酵豇豆正交優化試驗

在單因素試驗基礎上，以感官評分、總酸含量為考察指標，對鹽添加量、雪蓮菌接種量、發酵時間、發酵溫度進行正交試驗以確定最優的豇豆發酵條件。正交試驗因素水平見表1，試驗設計及結果見表2。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal test design

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal test design and results

由表2可知，感官評分的最優方案為A2B3C2D2，即鹽添加量4%、雪蓮菌接種量2.0%、發酵時間4 d、發酵溫度25 ℃，各因素對感官評分影響大小依次為D>A>C>B。總酸含量的最優方案為A2B2C2D3，即鹽添加量4%、雪蓮菌接種量1.5%、發酵時間4 d、發酵溫度30 ℃，各因素對總酸含量影響大小依次為D>B>C>A。由表3可知，各因素對總酸含量影響均為極顯著(P<0.01)；除雪蓮菌接種量對感官評分影響為顯著外(P<0.05)，其他3個因素對感官評分影響均為極顯著(P<0.01)。綜合考慮，確定豇豆發酵最佳工藝條件為鹽添加量4%，雪蓮菌接種量1.5%，發酵溫度25 ℃，發酵時間4 d。此條件下發酵豇豆的感官評分為87分，總酸含量為3.40 g/kg(n=3)，且發酵后的豇豆色澤均勻呈金黃色，脆性較好，香氣純正撲鼻，酸咸適口，滋味鮮美。

表3 正交試驗方差分析表?Table 3 Variance analysis

2.3 發酵前后豇豆風味變化

泡菜的風味可以通過乳酸菌發酵進行改善[21-22]。利用HS-SPME-GC-MS檢測發酵前后揮發性物質含量的變化見表4。由表4可知，豇豆原料中共檢測出26種揮發性物質，醛類和醇類是新鮮豇豆中的主要揮發性物質，與劉洪[12]55的研究結果一致。發酵后共檢測到揮發性物質72種，其中酯類、醇類、醛類、酮類、酸類、酚類、烷烴類、烯烴類分別為23，22，8，6，4，3，4，2種。產生的56種新物質中醇類和酯類最多，約占總揮發性物質的85%，使泡菜香氣更加豐富；其次是酮類和醛類。Park等[23]研究發現，發酵條件不同使得發酵后樣品中揮發性化合物的種類和含量不同。雪蓮菌發酵后各類物質的含量與自然發酵相比均較高，有24種物質在自然發酵中未檢測到，主要是因為發酵體系中菌種不同，其代謝速率不同，致使代謝產物積累的量不同。雪蓮菌發酵后揮發性物質的種類和含量更加豐富[24-26]，可為泡菜提供濃郁的香氣。

表4 豇豆發酵前后揮發性物質含量變化?Table 4 Changes of volatile compounds content in cowpea before and after fermentation mg/kg

續表4

續表4

豇豆發酵后醇類含量較高，主要是因為葡萄糖降解和氨基酸分解代謝所致[27]。大多數醇類都具有明顯的花果香味[28]。其中乙醇含量最高，分別為20.43，18.61 mg/kg。由于乙醇具有中性香氣，會直接影響泡菜的整體風味，也會影響其他風味化合物的保留[29]。此外，異戊醇和1-辛烯-3-醇含量較高，為泡菜香氣提供重要貢獻[30]。醇類與有機酸之間相互作用生成酯類物質，其風味閾值較低，對泡菜的風味有較大的貢獻。酯類中乙酸乙酯(具有香蕉和蘋果香味)[31]的含量較高，雪蓮菌發酵后其含量為19.92 mg/kg。

新鮮豇豆中的醛類含量較高，為26.64 mg/kg，尤其是己醛。發酵后，泡菜中的醛類含量減少，但高于自然發酵的，尤其是E-2-庚烯醛含量較高。醛類物質不穩定，易被氧化為酸或還原為醇，且濃度較高會產生異味[32]。所以在泡菜的揮發性物質中，醛類物質含量較低。醛類的微量存在同樣對泡菜的風味產生重要影響，是構成泡菜獨特風味的重要成分[20]。

酮類化合物在低濃度下仍會表現出強烈的風味[21]。發酵后，酮類含量上升，其中2-庚酮、1-戊烯-3-酮、香葉基丙酮和2-壬酮具有水果、花香等香氣[33]，僅在發酵后產生，其濃度低于閾值，但仍可以協同促進泡菜的香氣。

發酵后，酸類、酚類、烷類和烯類含量升高，且種類和含量高于自然發酵的，其中異戊酸、辛酸、4-乙基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚含量較高，對泡菜香氣有重要貢獻。

3 結論

通過單因素試驗和正交試驗，得到了雪蓮菌發酵豇豆的最佳工藝條件，即鹽添加量4%，雪蓮菌接種量1.5%，發酵溫度25 ℃，發酵時間4 d，此條件下發酵豇豆感官評分為87分，總酸含量為3.40 g/kg。經氣相色譜—質譜聯用檢測分析，雪蓮菌發酵豇豆后鑒定出72種揮發性物質，除醛類外，其他物質含量均升高，說明發酵后泡菜的揮發性物質較豐富。與自然發酵相比，雪蓮菌發酵后的泡菜揮發性物質種類與含量均較高，其中有24種物質在自然發酵中未檢測到，這些物質為泡菜的香氣提供了重要的貢獻。綜上，雪蓮菌發酵蔬菜具有可行性，可以改善泡菜的風味，使得發酵后的泡菜香氣濃郁。泡菜發酵的特征風味不僅與風味物質的種類和含量有關，也取決于各物質的閾值，以及各物質對總體香氣的貢獻，后續可以通過氣相色譜—嗅聞—質譜聯用法，確定雪蓮菌發酵豇豆的特征風味。